《病毒检验技术》.pptVIP

病毒检验技术;本 章 内 容 ;学习目标及重点 ;病毒学检验技术是用实验室检验方法对临床和流行病学现场送检的标本（如人或宿主的血液、组织、尿、粪便和组织液等）进行病毒学的定性和定量分析，为病毒感染和病毒性疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。 检验程序包括标本的采集、分离培养鉴定、快速诊断。;第一节 标本的采集、处理与运送 ;第一节 标本的采集、处理与运送 ;第一节 标本的采集、处理与运送 ;二、标本的运送与保存 1.标本的运送 尽快送检 冷冻、冷藏运输 防漏、专人、标记 2.标本的保存 -70℃可较长时间保存 可加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活 ;不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于目的病毒的生物学特性。 主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。;一、 病毒的分离培养 2.鸡胚培养 ;;1.原代细胞 原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。 2.二倍体细胞 是指原代细胞在体外分裂50代以后仍能保持其二倍染色体数目。二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。;3.传代细胞 传代细胞来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中变异的细胞称为传代细胞，它们能在体外无限期地传代。大多是肿瘤细胞或突变的二倍体细胞。 常用的传代细胞株有Hela细胞（人宫颈癌细胞），Hep-2（人喉上皮癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）等。;2.鸡胚培养;一般选用9～14d的鸡胚;选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键 常用的主要有： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种;2.鸡胚培养;卵黄囊接种;3.动物接种;二、病毒增殖的观察 （一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1．细胞形态的改变 2．红细胞吸附 3．细胞培养液pH值改变 （二）病毒数量及病毒感染性测定 1．血???试验 2．中和试验 3．空斑形成试验 4．半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50） ;二、病毒增殖的观察 （一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1．细胞形态的改变 （1） 细胞病变效应（cytophathic effect，CPE）;正常细胞 病变细胞; （2）多核巨细胞;（3）包涵体;2．红细胞吸附 有些病毒感染细胞后,细胞膜上可镶嵌着病毒基因编码产生的糖蛋白,其中有些能吸附特定种类的红细胞,或将细胞培养单层刮下后,经过适当处理,可以凝集特定种类的红细胞,此类糖蛋白在细胞表面形成刺突,称为血凝素。 3．细胞培养液pH值改变;（二）病毒数量及病毒感染性测定;能使红细胞完全凝集的病毒的最高稀释倍数为该病毒的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU） ;;2．中和试验（Nt） 在体外孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，经培养后观察CPE或红细胞吸附现象是否消失，即特异性抗体是否中和相应病毒，从而测定残存的病毒感染力的一种方法;是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。 将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的空斑/蚀斑(plaque)。 每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑形成单位 (plaque forming unit, PFU)。 病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。;4．半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）; 第三节 病毒学检测及诊断;2. 电子显微镜检查： *透射电子显微镜 用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等 *扫描电子显微镜： 用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等 ;H1N1流感病毒电子显微镜图片;（1）标本制备 ;二、血清学检测及诊断 原理：用已知的病毒抗原检测患者血清中的抗体水平或 用已知的病毒抗体直接检测标本中的病毒抗原 1.病毒抗原的检测：用荧光素、酶或胶体金等标记物标记病毒抗体检测标本中的相应病毒抗原。如ELISA检测HBsAg ;2.病毒抗体的检测：已知病毒抗原多数为通过基因工程技术制备的重组抗原，