《聚合酶链式反应》.pptVIP

聚合酶链式反应;1、基因克隆（感受态细胞制备、转化、质粒提取、酶切鉴定） 2、Western blot（蛋白质提取、SDS、转膜、免疫检测） 3、RT-PCR（RNA 提取、逆转录、PCR）;分子生物学技术;Kary B. MullisUSA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method ;;PCR; PCR 基本原理 PCR反应体系 PCR 结果分析 PCR 方法拓展 PCR 的应用;PCR 的基本原理;5’;DNA的体内复制：;Denaturation（变性）;Annealing（退火）;Extension（延伸）;变性-退火-延伸 —— 一个PCR循环;尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化反应趋于饱和平台效应 (Plateau) “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。 ;理论上，n个循环后，产量为2n拷贝。 实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n， X为扩增效率，平均为75%;PCR反应体系与反应条件;template;primer;引物的3端: 必须严格互补 引物的5端: 可以不严格互补,可以加酶切位点， 加标记物,引入突变位点等;5’-ggttacttccctcgatttgg gcggggattcccttccatttt tttcttcccttttctcccaagatccagcttcttggggg cactcacgggtgcccgttgcgttctgctccgtcg gcccc/ggagctgcatggccaactcccaccag gggccgctcctcccctaccccccacccccggg ctccctctttaagtctctagctcaaggtaccc gcct ctccaaagggctcgtccc-3’(229bp) ; ;(dNTPs) ;buffer /Mg2+ ;PCR反应条件;Analysis of PCR products;;Restriction-endonuclease digestion analysis： 酶切、电泳分离。 产物的鉴定，基因分型，研究变异性。;Hybridization ： (Southern blot/dot blot );Sequence analysis：是检测PCR产物特异性的 最可靠方法。;DNA测序;;Sanger法测定DNA序列;;2.DNA自动化测序;DNA自动测序结果举例;PCR METHODS; HOT START PCR In hot-start PCR ，at least one reaction component,which can include the polymerase, salt (KCl or MgCl2) or dNTP(s), is withheld from the reaction until the system reaches a particular temperature.;RT-PCR(Reverse transcription-PCR);;Semi-Quantify RT-PCR;Target Gene;;REAL TIME QUANTITATIVE PCR;实时PCR的基本过程;;基因克隆 医学检测 (基因诊断) ;一、基因克隆:;;PCR法;再次PCR;(一). 基因突变的检测 1、基???缺失或插入 ;2、点突变 位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法 不在酶切位点上的点突变：单链构象多态性分析法(PCR-SSCP) 致病基因上的未知点突变： PCR-SSCP ;PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)限制性 片段长度多态性;PCR-RFLP;Homozygous Mutant;单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)的原理及特点;SSCP;Denature samples in Formamide and Heat;（二）基因异常表达的检测 即检测致病基因的mRNA，在表达水平提供基因功能是否正常的直接证据。可采用RT-PCR，灵敏度更高。 （三）外