《蛋白质样品的制备》.pptVIP

⑵ 还原剂 还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的还原剂有β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前常用的是DTT。 ⑶ 去污剂（表面活性剂） 去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂NP-40和TritonX-100，两性离子去污剂CHAPS。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移位置。最初，两个相似的非离子去污剂NP-40和TritonX-100被广泛应用。随后研究表明：兼性离子去污剂CHAPS的效果更好。 二、裂解技术 ⑴ 裂解液的组成 裂解液基本成分包括：脲、一种或几种去污剂（还原剂、固相PH梯度缓冲液也可以增强样品的溶解性） 脲：可溶解和折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中（硫脲的加入可以进一步提高溶解度，特别是对膜蛋白） 去污剂：确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白质聚合 还原剂：可以断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原状态。 载体两性电解质和固相PH梯度缓冲液也包含于裂解液中：通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白质聚合来增强其溶解性。 ⑵ 裂解策略 对每一种样品而言，适宜的裂解步骤可由经验而定，其目的均是尽可能地完全溶解、解离、变性和还原蛋白质。 通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。 第四节 样品预分级 一、亚细胞器的分离 主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度 不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密 度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组 分。 ㈠ 细胞匀浆 取待分析的组织细胞样品以0.9 ％NaCl溶液反复 清洗，加入SE缓冲液（0.25mol/L蔗糖、1mmol/L EDTA)，在低温下研磨成匀浆备用。 ㈡ 亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离 1.差速离心 指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在不同离心力场的作用下沉降而分离。 2.密度梯度离心 指用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层分离。 ⑴速度沉降 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降。 ⑵等密度沉降平衡 适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 二、细胞的分离 临床样品都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常采用癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，也就是多种细胞甚至是组织蛋白质组混合物的比较。 常采用激光捕获微切割技术分离细胞 三、分步裂解提取 1.目的与原理 由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。 分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相pH梯度的等电聚焦中有待进一步的研究。 2.方法 Molley等(1998)首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下： ⑴水溶液的提取 约5-15mg细胞中加入2ml裂解液Ⅰ（40mmol/L Tris）。反复冻融3-4个循环，加入适量的DNase Ⅰ和RNaseA，震荡混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取物。 ⑵ 含Urea/C