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蛋白质相互作用技术研究的几种技术 酵母双杂交 谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pull down） 免疫共沉淀 双分子荧光互补技术(BIFC) 生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ）技术 常用蛋白质相互作用的研究技术 一、细菌双杂交系统 Two-hybrid system 是90年代初发展起来的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。 基本原理： 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的,如GAL4 （酵母转录激活蛋白Gal4的基因）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。 酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(BD)， C端：113个氨基酸组成的转录激活域(AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。 组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主菌株。 BD A COOH AD B NH2 COOH 共转化 + BD A AD Gal4 Gal4 Promoter Reporter NH2 Gal4 Gal4 B 酵母双杂交基本过程 举 例 二、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pull down）原理 GST-融合蛋白 GST X Y 谷胱甘肽-琼脂糖球珠 细胞裂解物 tube 4℃下孵育2h GST X Y + GST pull down实验流程 （1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。 （2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经处理过的beads置于1.5ml离心管中， 4℃, 摇床孵育过夜。 （3） 孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。 （4） 将菌体用溶菌酶处理，之后破碎细菌壁，最大转速4℃离心20min,收集上清液。 （5） 将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4℃，摇床3h。 （6） 3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。 （7） 加15μl 2×SDS上样缓冲液，煮沸5min. （8） SDS,Western Blot或质谱仪分析。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。 三、免疫共沉淀原理 三、免疫共沉淀原理 免疫共沉淀实验流程 （1）将菌体用溶菌酶处理，冰上裂解30min,之后破碎细菌壁，最大转速4℃离心30min,收集上清液。冰上裂解30min, （2） 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细菌裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜。 （3） 取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min。 （4） 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。 （5） 免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底。将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次。最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟。 （6） SDS, Western blotting或质谱仪分析. 四、双分子荧光互补技术( bimolecularfluorescence complementation , BIFC) BiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到