《蛋白质的修饰和表达》.ppt

三、昆虫杆状病毒表达系统 核型多角体病毒的多角体蛋白基因是病毒感染晚期高效表达的基因。 1、其缺失对病毒复制增殖毫无影响，可以作为外源基因理想的插入位点。 2、多角体蛋白被外源基因取代后，不形成多角体，在显微镜下可以与野生型相区别。 （一）杆状病毒表达系统的原理 首先建立一个转移载体质粒，在这个转移载体上含有多角体蛋白基因的启动子及多角体蛋白基因的旁侧序列；然后将外源基因克隆至转移载体的多接头的合适酶切位点处，使其处于多角蛋白基因启动子的控制之下；再将重组转移载体与野生型病毒DNA一起共转染昆虫细胞，外源基因通过细胞内同源重组而插入病毒基因组中。最后利用空斑形态形态的差异进行筛选、纯化重组病毒，再以纯化的重组病毒感染宿主细胞或幼虫，即可获得大量的外源基因表达产物。 （二）杆状病毒表达系统的特点 1、重组蛋白具有完整的生物学功能 2、能进行翻译后的加工修饰 3、表达水平高 4、能容纳大分子的插入片段 5、能同时表达多个基因 6、适合表达细胞毒性蛋白 7、安全 不足之处： 1、非连续性表达。重组杆状病毒能导致宿主死亡，所以每一轮外源蛋白的表达必须重新感染新鲜的培养细胞或宿主 2、其表达产物的糖基化相对简单，多不分支，糖侧链甘露糖成分高，缺乏符合寡糖。 三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达 1．哺乳动物细胞表达体系的优点 哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。 实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。 分泌型哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。 哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处 是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。 2、表达载体的类型 分为病毒载体和质粒载体。 病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用：腺病毒、逆转录病毒等。 质粒载体是借助于化学方法和物理方法将DNA直接导入细胞中。分为整合型和附加体型两类。 3、表达载体的结构元件 必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。 视实验需要还可加入标志基因、复制起始点序列、内部核糖体进入位点等。 4、宿主细胞 常用的表达重组蛋白的细胞株有CHO细胞、骨髓瘤细胞株、COS细胞、293细胞等。 不同细胞对重组细胞的修饰可能会稍有差别。如CHO细胞表达的人白血病抑制因子N端的氨基酸有所缺失。 5．两个主要的哺乳动物细胞表达系统 在哺乳动物细胞中有三个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，二是稳定表达系统，三是诱导表达系统。 瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。 稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。 诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。 四、体外翻译系统 又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对细胞内表达系统而言的开放表达系统。翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改变。 目前有兔网织血红蛋白系统、麦胚提取物系统、E.coli S30系统。 兔网织红细胞系统 由红细胞分化而来，在体内主要负责合成大量血红蛋白以及球蛋白。 优点：本身不带细胞核，但却保留了高效翻译各种核酸信息的能力，可减少背景；合成外源蛋白的效率接近合成外源蛋白质的效率；内源核酸酶少，有助于RNA的稳定；具有一定的翻译后加工活性。 (4) 强的转录终止序列 高效表达的载体应该含有终止子，因为合成的mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。 (5) 核