限制性内切酶的应用ppt参考课件.ppt

RFLP在遗传病检测中的应用 镰状细胞贫血症（? globin，?6 ），其GAG?GTG的突变，可用RFLP（Mst II，CCTNAGG）或PCR-SSCP检出。 甲型血友病（FVIII－，XR） 可用PCR-RFLP检出。 142 bp 99 bp * 引起镰刀型红细胞贫血症的原因就是基因的点突变，即编码血红蛋白β肽链上一个决定谷氨酸的密码子GAA变成了GUA，使得β肽链上的谷氨酸变成了缬氨酸，引起血红蛋白的结构和功能发生了根本的改变。β肽链基因上单个核苷酸的替换A→U恰好使该基本片段丢失了可被Mst II或CvnⅠ切开的一个限制性内切酶位点。由于基因突变改变了限制性酶切的结果，用Southern blot分析方法和限制性片段长度多态性（简称RFLP）分析方法即可对镰刀型红细胞贫血症胎儿做产前诊断，或对发病家族成员的基因组型进行分析。 * * 0.5 μg的1kb DNA Ladder 0.8%TAE琼脂糖凝胶，EB染色 * 数据库 限制性内切酶的数据库/rebase 其中含有已知的所有限制性内切酶的完整表，包括识别的序列，甲基化的敏感性，商业信息和参考文献。 * 应用中的注意点 1、建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1ug lambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。 * 2、选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接 * 3、加酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。 * 4、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素 * 5、缓冲液 对于每一种酶都提供相应的最佳缓冲液，可保证酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响 * 限制性内切酶的应用 病毒免疫室 * 限制性内切酶的发现 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司寻找更多的限制性内切酶 * 限制性内切酶的特点 限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大 除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现 在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。 * 限制性内切酶的主要功能 保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。 * 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶（甲基化酶）出现。后者的作用是保护细胞自身的DNA不被限