病毒及其疫苗的生产制备关键技术.docVIP

第25章 病毒及其疫苗生产制备技术 第一节 病毒生产制备 病毒需在活敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，大家为研究病毒，往往采取鸡胚接种或动物接种方法来分离、判定病毒或制备一定量病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅很多病毒难以找到适宜敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果判定，伴随细胞培养技术发展，首先在病毒学研究方面取得了广泛应用，为病毒繁殖、判定提供了来自不一样动物（包含人）、不一样组织细胞起源，经过敏感性筛选，现在绝大多数病毒均可有对应敏感细胞，为病毒分离、判定和增殖发明了条件。同时也为病毒大量生产提供了细胞起源，伴随细胞大量生产技术发展，所以对病毒来说只要有敏感细胞，就能够进行大规模生产。 一、病毒生产目标和用途 1、为了制备大量病毒抗原，以制备病毒亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。 2、为了制备病毒减毒活疫苗或灭活死疫苗，以用于预防接种。 3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子病毒，以用于基因诊疗或杀肿瘤诊疗及基因疫苗预防接种。 4、为了制备干扰素病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素生产。 5、生物战用病毒生物战剂。常选择毒力强、抵御力强、对不一样国家人群最敏感病毒，又能经过气溶胶或昆虫和污染水土进行传输病毒。这是战争狂们正在开展研究，应警惕。 二、病毒生产制备方法 1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采取鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。 2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，现在尚无敏感细胞，常采取9～10日胚龄尿囊腔接种，37℃ 3、细胞培养法（详见第二篇第18章） 不一样病毒选择对应敏感细胞，采取转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量病毒,继续培养合适时间时，冻融细胞后，离心收获上清。 以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成份，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。 第二节 病毒疫苗生产制备 病毒疫苗生产制备和病毒生产制备基础相同，现在进行人工主动免疫，用于病毒病预防疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。 一、病毒疫苗种类 (一)灭活疫苗：现在常见有流行性乙型脑炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍体细胞和地鼠肾细胞可用于生产狂犬病病毒固定毒灭活疫苗），流感灭活疫苗。常见甲醛为灭活剂，以灭活病毒核酸而不影响其抗原性。 (二)减毒活疫苗，通常采取自然法或人工法，经过动物传代或细胞传代筛选对人毒力低变异株病毒。常见有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗和部分联合疫苗（如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗）。 (三)亚单位疫苗：用化学试剂裂解病毒，提取包膜或衣壳上亚单位，除去其核酸，以此制成疫苗称亚单位疫苗。如流感病毒包膜提取后制成血凝素和神经氨酸酶亚单位疫苗。 (四)多肽疫苗：采取乙肝携带者血提取HBsAg乙型肝炎疫苗或采取基因工程法制备HBsAg基因表示产物制备疫苗。 (五)基因缺失减毒活疫苗：在病毒基因组中，使其有毒力相关基因发生缺失而制成减毒活疫苗称基因缺失减毒活疫苗，如狂犬病毒胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3区缺失株（第二代），单纯疱疹病毒α22基因缺失株，现在有待深入研究。 (六)基因工程亚单位疫苗：将病毒表面抗原基因，经过基因重组，在酵母或CHO细胞中进行表示亚单位多肽抗原成份而制成疫苗，称基因工程亚单位疫苗，如乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg基因在酵母和CHO细胞中表示而提取取得纯品HBsAg多肽。立即上市。 (七)重组牛痘多价活疫苗。以牛痘苗为载体来表示数十种外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成牛痘苗病毒，经一次划痕接种可使机体同时能取得对多个病毒免疫力，大大降低了接种次数。另外腺病毒和脊髓灰质炎病毒活疫苗也可作为载体和轮状病毒抗原基因重组后活疫苗，经口服后可同时取得两种病毒免疫力，有待于深入研究、开发。 上述病毒疫苗有是采取细胞培养技术和细胞工程来进行生产制备，现将采取细胞工程制备病毒疫苗种类和敏感细胞和生产方法规于下表。 二、细胞培养法制备常见疫苗（如表25-1）。 表25-1 采取细胞培养法生产常见病毒疫苗 疫 苗 制备疫苗 细 胞 培养方法 名 称 活/死(疫苗株) 脊 髓 灰 灭活（Salk株） 猴肾细胞（原代/2-3代） 转瓶培养 质炎疫苗 活（Sabin株） Vero细胞 微载体培养 腮