最新-课题5DNA的粗提取与鉴定精品.doc

【课 题】： 课题5 DNA的粗提取与鉴定 【备 课 人】： 【备课时间】： 【上课时间】： 【课 型】：复习 【课 时 数】：1课时 【复习目标】 本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。 【复习重点与难点】 复习重点：DNA的粗提取和鉴定方法。 复习难点：DNA的粗提取和鉴定方法。 【知识回顾】 一、实验原理 提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理 和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 1．DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。 此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以 将DNA与蛋白质进一步的分离。 2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 oC80的高温，DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—蛋白质蛋白酶能水解，但是对 oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。而DNA在80 3．DNA的鉴定 在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 二、实验设计 1． 实验材料的选取 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的 可能性更大。 2．破碎细胞，获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时 用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。 例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研 磨，过滤后收集研磨液。 注意： ①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。 ②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。 ③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响? 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 ④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。 2． 去除滤液中的杂质 方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。 注意： ①为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？ 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 ②方案二与方案三的原理有什么不同？ 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。 3．DNA的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会 出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸 取上面的水分。 取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。 混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看 看溶解有DNA的溶液是否变蓝。 三、实验步骤—以洋葱为实验材料 1．称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。 洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又