彗星实验要点.pdf

1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮， 用 CASP 软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些 教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细 胞中的 DNA 片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用 的 是 中 性 条 件 ， 20V ， 200mA,20min, 凋 亡 细 胞 观 察 宜 选 用 10V,100mA,10min 。朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。 2、 解旋 20 分钟应该没问题， 但是我认为您的电泳时间过长， 当然我不知道 您的电泳条件（电压、电流、 ），我认为 20 分钟足够了，时间长了一是浪费 时间，二是彗星图像不好， 不利于分析。 您的裂解时间有点短了， 文献报道， 最好不要少于 1.5 小时 3、一般 100ul0.5 ％低熔点胶中含 400 个细胞就足够了 4 、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看 /bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&ag e=0 5、注意，CASP只读.tif 扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有 .tif 格式，就更好了，如果是 .jpg 格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简 单 6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。 其次，您的染色液量我觉得多了点，我用 2ug/ml ，1ml 注射器 1 滴就可以。 第三，要忠于实验结果， 图象内容不能更改， 可以用 ACDSEE或 PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好 7、。背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影 响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大 影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。注意，背景框可以 在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一 个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再 把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背 景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比 性。 结果的保存，记得好像使用说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创 的！！！呵呵，先卖个关子。 FILE 菜单下有一个 EXPORT RESULTS（输出结果） 的按钮，点击以后，默认是 .TXT 文本文件，好了，给你的输出文件起个名字， 选择保存位置，点击确定就 OK 了，回到你保存的输出结果文件，发现它是 一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成 .TXT，打开它，看看你的 结果，包括 13 个指标，很好，这个 .TXT 的结果文件可以被 SPSS统计软件 直接识别，不是很方便吗？？ （如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件， 我也没意见，呵呵）。这里还有一个小窍门，在用 SPSS读取之前，最好把你 的结果文件调整一下，这也是我发现的。把所有的指标都排列到第一行，下 面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的） ，行与行之间 不要用回车， 就是不要有空行， 其实调整起来很简单， 主要是调节 .TXT 文本 文件阅读框的宽度。调好后， SPSS 软件直接识别，很方便，为你节省很大 工作量，不信就试试。 8、我用双层铺胶法， 自制微电泳槽， 第一层 :0.75 ％正常熔点胶， 100 μl， 第二层： 0.75 ％低熔点胶， 75 μl+25 μl淋巴细胞悬液，用枪直接把凝胶吹到 自制的微电泳槽中，铺平即可。第二层以相同的方法铺到第一层上面，不必 担心脱胶的问题。 9、盖玻片用普通的就可以了，但是可以自做的，普通的盖玻片其实有点小了， 如果胶很多的话