引物的设计及测序的结果分析.pptVIP

第三章引物没计及测米:) 严冬善 yoh com  3.1引物设计 (primer design)  引物的定义 ●引物( primer)是一段短的单链DNA或RNA片段,可结合在 DNA模板链上与之互补的区域,作为DNA复制的起始点。 体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应( Polymerase Chain reaction,PCR)、测序和探针合成等。 ●引物设计是PCR技术中至关重要的一环,其优劣直接关系到 PCR的特异性和实验能否成功。  PCR的基本原理 三步循环:变性、退 DNA模板 火、延伸 95℃(解链) ●1变性:双链DNA解 链成为单链DNA DNA单链 退火:部分引物与 60℃(退火)与引物结合 模板的单链DNA的 Reverse primer orward primer 特定互补部位相配对 和结合 72℃(延伸)Taq酶, dNTPs, Mg2 3延伸:以目的基因 为模板,合成互补的 新DNA链  PCR Primers CACTACAAGGACTGCCATGAG ATTTCAGTGGCACCTGCCTGG AAGTCACCGTGGACGGACC 5 5’ CACTACAAGGACTGCCATGAG→ 3-GTGATGTTCCTGACGGTACTC TAAAGTCACCGTGGACGGACC Forward primer/sense primer: 5CACTACAAGGACTGCCATGAG Reverse primer/anti-sense primer 5CCAGGCAGGTGCCACTGAAAT  琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(1) MⅡ61 65N 1200bp 8B8 三 500bp 300bp 100bp  DNA模板链、编码链与转录及翻译的关系 5… GCAGTACATGTO…3’编码謎(CDS) 3… cgtcatg tacan…5′模板 反转录 转录 5… GCAGUACAUGUO…3′mRNA 翻译 N……Ala·Val·His·Val……C蚕白质  PCR模板:cDNA CDS( coding sequence)是编码一段蛋白产物的DNA序 列。一般以ATG开始,以TAA、TAG、TGA结尾。 cDNA( complementary DNA)是与RNA链碱基互补的 单链DNA,此DNA链与其碱基互补的DNA链所形 成的DNA双链。  、引物设计流程 序列查找和下载 序列同源性比较 引物设计与筛选 引物加工与修饰 引物的评价分析 引物的二次筛选 引物的最终评估  、引物设计原则 (一)基本原则 引物与模板的序列要紧密互礼 ●引物与引物之间避免形成稳定的二聚体( dimer) 或发夹结构( hairpin) ●引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反 应(即错配)