病理检验技术 （一）组织的特殊染色 酶类—琥珀酸脱氢酶.pptxVIP

病理检验技术;特殊染色;酶类 ;琥珀酸脱氢酶;硝基蓝四唑法(根据 Pearson) (一)试剂配制 1. 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6) 2. 0.1mol/L玻珀酸钠 3. 孵育液：硝基蓝四唑 10mg、二甲基亚砜 1ml、 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6) 5ml、0.1mol/L琥珀酸钠 先把硝基蓝四唑加入二甲基亚砜溶解,然后加入其余两液并充分混合 4. 10%的中性甲醛液 5. 80%的乙醇;(二)染色步骤 1. 新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),切片厚6μm,贴于玻片,风扇吹干30分钟。 2. 置于-18℃冷内酮固定10分钟 3. 浸入预热于37℃温箱的孵育液孵育10~30分钟,定时观察切片蓝色不再加深为止。 4. 蒸馏水稍洗2次,每次2-3秒。 5. 10%的中性甲醛液处理10分钟。 6. 80%的乙醇处理5分钟。 7. 流水冲洗3分钟。 8. 常规脱水透明,中性树胶封固。;(三)结果 琥珀酸脱氢酶活性部位处呈蓝紫色颗粒。 (四)对照方法 1. 配孵育液时,用等量的蒸馏水代替0. 1 mol/L琥珀酸钠,结果应为阴性。 2. 在孵育液内加入0.05mol/L丙二酸钠,结果应为阴性。;(五)注意事项 1. 取材要迅速,立即低温冷冻,否则容易引起酶的扩散。 2. 磷酸盐缓冲液易发霉,置冰箱也不能久存,不宜多配,如有絮状沉淀或发霉则不能使用,如放冰箱有结晶析出,可用温水浸片刻使结晶溶解后仍可用。 3. 二甲基亚砜可促进硝基蓝四唑溶解,使线粒体膜的通透性增强,作用快,酶定位清晰。也可用二甲基甲酰胺代替,两者皆不影响琥珀酸脱氢酶的活性。 4. 硝基蓝四唑法也可用于显示横纹肌的两型肌纤维。1型肌呈强阳性,Ⅱ型肌呈弱阳性或中度阳性。 5. 四唑盐有多种,如氯化三苯四唑(TTC)、蓝四唑(BT)、新四唑( NT)、溴化二甲基噻唑基二苯基四唑(MTT）、硝基蓝四唑( nitro-BT)及四硝基蓝四唑( TNBT)等,但以后两种最佳,这两种四唑盐均较稳定,生成蓝紫色的双甲攒沉淀,不溶于水及有机溶剂。;(六)染色机制 此法是利用琥珀酸脱氢酶的脱氢作用,从底物琥珀酸钠中释放的氢与硝基蓝四唑作用,还原硝基蓝四唑为蓝紫色的双甲攒而定位于酶活性的部位。;(七)应用 琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的标志酶,根据此酶的活性情况,可测知细胞内的呼吸功能状况?? 心肌内的缺血改变或早期心肌梗死,此酶消失,但在细胞的自行分解过程中此酶较稳定,故可用于尸解组织的心肌,通过琥珀酸脱氢酶的分布情况以鉴定是否存在心肌梗死。 又可用以区分横纹肌的两型肌纤维即红肌和白肌。 红肌(1型肌)着色深,呈强阳性；白肌(Ⅱ型肌)着色淡,呈弱阳性。 琥珀酸脱氢酶活性在肿瘤组织中一般较低,但在某些肿瘤,如唾液腺、甲状腺和肾上腺皮质等的嗜酸性细胞腺瘤,巨细胞瘤的巨细胞与破骨细胞可显示最强的酶活性。