SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告.docxVIP

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量 一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称 PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成， 聚合过程由自由基催化完成。 催化聚合的常用方法有两种 : 化学聚合法和光聚合法。 化学聚合以过硫酸铵 (APS)为催化剂，以四甲基乙二胺 (TEMED)为加速剂。在聚合过程中， TEMED催化过硫酸铵产生自由基， 后者引发丙烯酰胺单体聚合， 同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液 pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 不连续体系由电极缓冲液、 浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由 AP 催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的 Tris-HCl 。分离胶是由 AP 催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为 Tris-HCl 。电极缓冲液是 Tris- 甘氨酸缓冲液。 2 种孔径的凝胶、 2 种缓冲体系、 3 种 pH 值使不连续体系形成了凝胶孔径、 pH 值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内 和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而 强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断 裂。在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS后，分子被解聚成多肽链，解 聚后的氨基酸侧链和 SDS结合成蛋白 - SDS 胶束，所带的负电荷大大 超过了蛋白原有的电荷量， 这样就消除了不同分子间的电荷差异和结 构差异。 SDS一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比， 能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上， 经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选 TRIS/HCl 缓冲液，电极液选 TRIS/ 甘氨酸。电泳开始后， HCl 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动， 其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度， 使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动， 形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式 : 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native) 及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS);非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够 保持完整状态， 并依据蛋白质的分子量大小、 蛋白质的形状及其所附 带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 而 SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由 shapiro 于 1967 年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂 (SDS即十二烷基硫酸钠 ) 后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小 ( 可以忽 略电荷因素 ) 。 二、实验目的 学习 SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用 SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。 三、实验原理 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 在一定的电场强度下， 分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。 聚丙烯酰胺凝胶 （PAG）是由单体丙烯酰胺 (Acr) 和交联剂甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和引发剂过硫酸铵 (AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。 以此凝胶作为支持介 质的电泳称为  PAGE。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变  Acr  浓度 或  Acr  与  Bis  的比例可以得到不同孔径的凝胶。 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中 缓冲液 pH值与凝胶中的相同 . 带电颗粒在电场作用下， 主要靠电荷和 分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、 分子筛效应，还具有浓缩效应， 因而其分离条带清晰度及分辨率均较 前者佳。 基本原理 SDS是在蛋白质样品中加入