卵黄抗体生产及应用技术[推荐].pptVIP

(二) IgY转移时间、产量及影响产量的因  素 1.用HI、ELISA、ID检查卵黄中IgY，抗体应答形成时间 晚于血清1～2周（Theresa H P,1985；鸭腺病毒），以后与血清测得的HI滴度一致，也有报道卵黄卵黄抗体具有累积作用； 2.经加强免疫，卵黄中特异性IgY效价能维持数月奶至1年； 3.一个卵黄约含100～400 mgIgY，一只产蛋鸡每年可获 得40～50gIgY（D .Carlander,2002），相当与30只家兔同期内血清IgG 产量； 4.卵黄中抗原特异性抗体数量占IgY平均10%，范围是5%（抗胰岛素抗体）～28%（抗鼠IgG抗体），取决于免疫个体、免疫程序及抗原的免疫原性； * 精品PPT·可编辑借鉴 续（2） 5.影响IgY产量的因素包括： （1）抗原的质与量（颗粒/可溶性抗原、类毒素/菌体抗原、活菌/死菌，免疫麻痹；高免疫原性和安全） （2）机体方面，A包括产蛋鸡品种（来航鸡、洛岛红鸡及其杂交后代的特异性IgY最高平均浓度有显著差异（D Carlander,2002)、B产蛋率和产蛋间歇与IgY浓度、C蛋重及卵黄重、D营养影响免疫系统发育、免疫机能状况和生产性能、E健康状况（SPF鸡群，起码应无免疫抑制性疾病和垂直传播性疾病，对父母代IBD的免疫） （3）免疫途径、免疫程序、佐剂 * 精品PPT·可编辑借鉴 续（3） 6.生产卵黄抗体典型的免疫程序（Li-Chan等，2000）： (1)首免，胸肌注射0.5～1mg/羽弗氏完全佐剂等体积乳化抗原； (2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐剂乳化抗原进行2～4次加强免疫，剂量逐步放大1～2倍。这种多次注射加强剂量的抗原使之产生较高自动获得性免疫的过程，称之为“超免疫作用”。 * 精品PPT·可编辑借鉴 （三）IgY结构特点 1.分子量160～180kDa，稍大于IgG（ 160kDa ）； 2.多一稳定区而少一铰链区（铰链区有较多脯氨酸，具有韧性，与抗体分子构型变化有关）； * 精品PPT·可编辑借鉴 续（1） 这种差异没有影响IgY的抗原-抗体结合特性和结合能力，结合价也是2（Warr等, 1995），然而对于pH、温度及蛋白水解等引起构象变化的环境条件，IgY比IgG稳定； 由于缺乏铰链区，两个抗原结合片段（Fab）紧密排列，使IgY缺少韧性及功能种类，在确定条件下沉淀及聚合反应能力降低（Warr等，1995），这使其具有抵抗幼龄动物胃酸屏障的能力。 3.IgY能介导过敏反应，与哺乳动物的IgE相似。 * 精品PPT·可编辑借鉴 （四） IgY相对IgG的优势 1.高度保守的哺乳动物蛋白质对禽有较强的免疫原性，且产生有效免疫反应所需抗原量小（Danielpour.D,1993），如IGF-1，且免疫应答快； 2.免疫反应具有交叉性，血缘越近，交叉反应程度越高；由于结构上差异，IgY 与IgG几乎没有交叉免疫反应，减少了非特异结合和假阳性；减少非特异性结合使免疫学检测灵敏性提高（达50%）； 3. IgY具有较强的抗热、抗酸、抗离子强度和一定的抗酶分解能力（相对于IgG），提纯后IgY在合适条件储存10年滴度没有损失（Olovson等，1993），幼畜可以口服，经保护处理后成年动物也可以口服，提纯后可以肌注（孙希琪，1995） ； 4.USDA和FDA认为卵黄抗体是GRAS（generally regarded as safe）且已允许商业生产用于人； * 精品PPT·可编辑借鉴 续（1） 5.符合动物福利原则。 因此，IgY具有可规模生产、成本低、特异性抗体含量高、安全性好等优点,比实验室条件下通过实验动物制备有限的高免血清更有实用性。 * 精品PPT·可编辑借鉴 （五）IgY纯化、活性测定及保存 1.鸡蛋储存在+4℃条件下6个月IgY活性损失很小。用做食品和饲料添加剂，或兽医临床上，IgY多以全卵黄或其水溶液的形式直接利用，或制成干粉利用。 2.用于诊断分析或纯化生物活性分子，或在人医临床上则需要提高IgY纯度或提纯特异性IgY。 IgY纯化分三步： 第一步是粗提，将含有IgY的水溶性蛋白与水不溶的脂类和脂蛋白分离，即除去脂质；方法有超滤、有机溶剂萃取、以及PEG、SDS沉淀脂蛋白等，经粗提的上清液或水溶液中IgY含量占蛋白质的15%； 第二步用硫酸葡聚糖钠等进一步沉淀，提纯出纯度大于80%的IgY，此时的IgY要低温或冻干保存； * 精品PPT·可编辑借鉴 续（1） 第三步是精提法：使用凝胶渗透层析、阴离子交换层析或超滤方法进一步纯化，获得纯度96%～99%的IgY。 3.Akita等建立的水稀释法：