干细胞诱导实验计划.docVIP

文档来源为 :从网络收集整理 .word 版本可编辑 .欢迎下载支持 . 干细胞诱导实验 材料 1.1 样品 高表达 ERα-36 的 SGC7901、低表达 ERα-36 的 SGC7901 和正常 SGC7901。 1.2 实验试剂 0.25%胰酶、 PBS 溶液、谷氨酰胺、 75%酒精、双抗、鼠尾胶原、胰岛素、上皮生长因子（ EGF）、成纤维细胞生长因子（ bFGF）。 附注：鼠尾胶原铺板方法 （1）配制 0.2%醋酸溶液，经高压蒸汽灭菌后备用； （2）将鼠尾胶原蛋白加入配好的醋酸溶液 (储存用浓度： 2mg/ml) ，放入 -20℃冰箱储存； （3）按每平方厘米取 2.5ul 鼠尾胶原母液加入到 6 孔板（每孔底面积 9.6cm2）中，使平皿含有 μ 2 5 g/cm 的胶原，用无菌推杆将鼠尾胶原平铺在皿底，打开强风吹 60min，待干燥，然后开紫外照射过夜（也可不照紫外，干燥后立刻使用） ，第二天使用。 1.3 仪器与设备 酒精灯、吸管、吸头、止血钳、 6 孔板（ 2 块）、记号笔、封口膜、废液缸、手套、口罩、三色枪头、移液器、试管架。 1.4 培养基 血清培养基 (SSM)：DMEM 培养基，其中添加了 5U/L 胰岛素和 10%的优级胎牛血清。 无血清培养基 ( SFM)：DMEM/ F12 (1:1) 中添加 5U/ L 胰岛素、20ng/ml 的 EGF 和 20ng/ ml 的 b FGF。 实验方法 2.1 肿瘤干细胞相关亚群的分离培养和传代 取 SSM 中培养的处于对数生长期的高表达 ERα-36 的 SGC7901、低表达 ERα-36 的 SGC7901 和 正常 SGC7901 细胞， PBS 液冲洗后用胰酶消化，加入 SFM 机械吹打成单细胞悬液并计数。以 5×104 个 /孔接种 6 孔培养板，放入 37 ℃、 5 % CO2、95 %湿度的培养箱中培养。 当培养板中 7d 形成细胞球后（若有必要延长至 14d-20d 直至成球）再培养 3d-4d（根据具体情况 来定，若细胞状态佳则培养 4d，若细胞状态不佳则提前一天接种）后接种于 SSM 中，接种 7d 后再 按照 2.1 的方法将消化下来的细胞接种于 SFM 中，循环重复实验 3 次。 2.2 细胞系中肿瘤干细胞相关亚群的由血清诱导分化 收集全部第 3 代细胞（成球和未成球的都收集起来）做 western blot 检测，观察 ER-α36、 CD24、 CD44 和 Vim 的表达。将培养出的第 5 代细胞球用 PBS 液冲洗后用胰酶消化，吹打成单细胞悬液后计数，按 1 孔：1 孔的比例将细胞接种于 6 孔板，用 SSM 培养， 6 孔板提前用鼠尾胶原包被，用于诱 导细胞向间叶方向分化。 每天用倒置相差显微镜观察其分化和生长情况。 当细胞贴壁、 分化并处于对数生长期时在 SSM 中连续传代。每代都收集 1 次细胞提取蛋白做 western blot 检测观察 ER-α36、CD24、CD44 和 Vim 的表达。 2.3 鉴定肿瘤干细胞及其想间叶分化的相关标志 通过 Western blot 方法来检测干细胞及其间叶分化的相关标志（ Vim 、 CD24、CD44、 ER-α36）。 2.4 细胞成球的观察内容 把细胞接种于 SFM 中，在不同时间点用倒置相差显微镜观察细胞生长情况。 12h 时，除了少量的细胞贴壁外， 其他大部分细胞呈悬浮状态， 为球形，相互有少量粘连 (图 1A) 。 24h 后，开始形成少量细胞球，约由 20～ 30 个细胞粘连组成，但仍有部分细胞贴壁 (图 1B)。 48h 后，产生大量的细胞团，细胞团体积明显变大，贴壁细胞进一步减少 (图 1C)。 72h 后悬浮细胞球形态更加规则，基本没有贴壁细胞。将细胞球用胰酶消化后传代，在 SFM 中 可再形成细胞球，如此重复，细胞总数可大量扩增。 用 SSM 常规培养的细胞在接种后 24h 内全部贴壁， 48h 后形成单层贴壁细胞层，有少量悬浮细胞，但没有悬浮细胞团 (图 1D)。 文档来源为 :从网络收集整理 .word 版本可编辑 .欢迎下载支持 . 见到这种成球的细胞团就拍下来 细胞培养实验流程图 SGC7901 SSM（贴壁） SFM（成球） 第一代细胞球鉴定 第一代细胞球 SSM+鼠尾胶原包被六孔板 连续传代 每代取细胞鉴定 第一代细胞球 SSM（贴壁） SFM（成球） 第二代细胞球鉴定 第二代细胞球 SSM+鼠尾胶原包被六孔板 连续传代 每代取细胞鉴定 第二代细胞球 SSM（贴壁） SFM（成球） 第三代细胞球鉴定 第三代细胞球 SSM+鼠尾胶原包被六孔板 连续传代 每代取细胞鉴定 细胞鉴定实验流程图 1.形态学鉴定 贴壁 照相