现代分析技术与应用：第十八章 高效液相色谱法.ppt

三、高效液相色谱类型 键合相色谱法 流动相的要求 pH一般应在2-8，否则会引起硅胶溶解 (也有适用宽pH范围的键合相) 与固定相不发生化学反应，化学稳定性好 对试样有适宜的溶解度。使k在1 ~ 10范围内 与检测器相适应。如用紫外检测器，应选用截止波长小于检测波长的溶剂 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱压，提高柱效 三、高效液相色谱类型 键合相色谱法 流动相的极性 正相色谱：溶剂极性参数P′越大，溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：强度因子S越小，洗脱能力越弱 流动相的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 必要时可选择混合溶剂（二元或多元流动相） 低粘度，流速不宜过快 三、高效液相色谱类型 键合相色谱法 流动相的洗脱 等度洗脱：在1个分析周期，流动相的组成不变 梯度洗脱：在1个分析周期，流动相的组成按一定时间程序连续或阶段改变，改变溶剂极性、离子强度、PH值等，使相应成分获得最佳分离 正相键合相色谱法 固定相：极性键合相，如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶） 流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂，如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂） 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物，如一些在硅胶柱上分离的物质 机制：分配（把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解），吸附（溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用） 分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。 反相键合相色谱法 固定相：非极性键合相，如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调节剂。常用甲醇－水、乙腈－水等。加入0.1% ~ 1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用 应用：最广，包括非极性至中等极性的组分（有机酸、碱及盐等） 机制：溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力。 反相键合相色谱法 保留行为（色谱峰）的影响因素 溶质的分子结构（极性）：极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 固定相：键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。 反相键合相色谱法 保留行为的影响因素 流动相：极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂比例：水为弱溶剂，醇为强溶剂；水的比例增加，使k增大 加入中性盐：中性溶质的k增大 pH：影响弱酸、弱减的离解，流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小 离子抑制剂：用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱 离子对：把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。 反相离子对色谱法 离子对机制 3 3 + + ( ) + 3 s 3 ( + 固定相 + ( ) + B ) + B + H+ BH RSO Na RSO + Na+ BH RSO RSO ) BH 离子对 m B + A B A m A ( s 流动相 通式 中性离子对与非极性固定相作用较强，保留增强，改善分离效果 离子对的影响因素 离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大。即使试样组分与离子对试剂全部离子化 固定相：尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相，同一般RP-HPLC 流动相：性质（有机溶剂及其浓度）同一般RP-HPLC 反相离子对色谱法 离子对的应用与选择 适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。 分析酸类或带负电荷物质：选用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等。 分析碱类或带正电荷的物质：选用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）。 反相离子对色谱法 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反 四、高效液相色谱的应用 环境污染物分析 食品分析：有毒物质、营养成分等 生化分析：氨基酸、蛋白质等 医学检验：内源性物质、药物浓度等 药品分析：药物成分、中药有效单体等 新药研发：药物分离、纯化、鉴定、浓度等 四、高效液相色谱的应用 定性分析 定量分析 内