农推-林业生物技术-基因工程综述.docxVIP

第二章 林木基因工程 ?2.1基因工程的基本知识 ?2.2植物基因的分离克隆 ?2.3植物遗传转化 ?2.4基因工程与林木遗传改良 2.1基因工程的基本知识 瑾因工程 戏传工程，重组DNA技术（DNA recombination） 匪指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重 组，然后将重组的基因导入受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种， 生产新产品的技术科学。 -可以跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因导入到新的生物中，实现不 同生物的基因重组或基因转移，达到对某种生物个别性状遗传改良的目的。 ■^现代生物技术的核心和支柱。 基因组 -某种生物体或一个细胞所携带的全部 DNA序列的总和。 义的基因组（genome ）是专指核基因组。 ■T义的基因组还包括叶绿体基因组和线粒体基因组。 核基因组 ■^指维持生物体完整生命功能所必须的1组染色体或配子体（性细胞）所包含的全 部 DNA序列（nDNA）。 一一个生物物种单倍体基因组的DNA含量称为该物种的C值，每一个生物物种的C值 是恒定的，一般用pg或碱基对表示。1pg=10-12g,相当于31cm长的DNA排歹0,约 109bp。 叶绿体基因组 T十绿体是植物进行光合作用的场所, M绿体中含有独立于核基因组以外的叶绿体基因组，称为 cpDNA。 -一个植物叶片细胞通常含有数白个叶绿体， —个叶绿体中含20-80个cpDNA拷贝。 诙艮杏的叶绿体基因组为158kb。 线粒体基因组 戏粒体是动植物细胞将有机物质氧化降解成水和二氧化碳、并释放出能量的细胞 器。 乜含有独立于核基因组以外的基因组，称为线粒体基因组，其 DNA称为线粒体基 因组 DNA (mtDNA)。 -植物的线粒体基因组比动物要大得多。 -植物线粒体基因组含有数目不等的内含子序列。 基因 哨旨编码功能蛋白质或RNA分子所必须的DNA序列或RNA序列，是遗传的功能单位, 可产生或影响某种表型。 股乂可分为 g吉构基因(structure gene):编码蛋白质(或 RNA) -调控基因(control gene):调控结构基因的表达。 犯常指结构基因。 真核基因的结构 2.2目的基因的克隆 ?2.2.1基因克隆的工具酶 ?2.2.2基因克隆的载体 ?2.2.3基因克隆的方法 2.2.1基因克隆的工具酶 邠艮制性内切核酸酶 restriction endonuclease ?DNA 连接酶 DNA ligase ?DNA 聚合酶 DNA polymerase 制性磷酸酶 ?S1核酸酶 林端脱氧核昔酸转移酶 2.2.1.1限制性内切核酸酶 邠艮制作用：一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源 DNA (如 噬菌体DNA)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。 准饰作用：生物细胞自身的DNA分子通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置发 生了甲基化，而得到修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。 2.2.1.1限制性内切核酸酶 往要有I型、H型、m型。 ? n型运用最广泛，I型和m型应用极少。 ?I型目前发现的只有EcoB和EcoK两种， ?用型目前已知的主要是 EcoPI和EcoP15。 ⑴II型限制性内切核酸酶的特点 能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位点通常具有双链回文对称的结构； 切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补，并能够重新连接； 切割和修饰功能由两种不同的酶催化完成; 切割不需要ATP和SAM (硫腺苜甲硫苜酸)作为活性催化因子。 命名和分类 利用届名的第1个字母和种名的前2个字母代表内切酶的来源。例如，来自大肠杆 菌(Escherichia coli )的内切酶用Eco来命名，来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae ) 的用 Hin表示。 第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。例如， Eco RI中的R表示该酶来自大肠杆菌 的R菌株。 在同一菌株分离获得的不同内切酶按照分离时间的先后，以罗马数字加以标注， 如HindI、Hindu、Hindm。 影响因素 DNA的浓度和质虽----最关键的因素。 酶切消化的缓冲液。 酶切反应的温度。 其它因素。 应用 构建重组的DNA分子。 探针准备。 DNA物理图谱构建。 DNA甲基化分析。 2.2.1.2 DNA 聚合酶 ?乍用： 将脱氧核糖核酸连续地连接到双链 DNA分子的3 -OH末端，催化核昔酸的聚合作用，形成长链的核酸分子。 大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow酶 大肠杆菌DNA聚合酶I的作用： DNA缺口平移，制备DNA探针。 用于DNA序列分析。 ?Klenow酶的主要用途： DNA放射性标记。 合成cDNA的第2链。 补平内切酶切割双链DNA分子形成的粘性末端。 DNA测序。 T4 D