焦磷酸测序地原理及引物设计.docxVIP

实用标准文案 Pyrosequencing RCR 1. 实验原理 ：焦磷酸测序采用生物素标记的引物进行 PCR扩增，将 PCR产物纯 化并变性为单链后，向其中加入四种酶的混合物： DNA聚合酶（合成 DNA双 链，释放 dNTP 的焦磷酸基团，释放出来的焦磷酸基团的量与和模板结合的 dNTP的量成正比）、 ATP硫酸化酶（在 adenosine 5 ′ phosphosulfate 存在的情况下催化焦磷酸基团形成 ATP）、荧光素酶（在 ATP介导下使荧光素转化为氧化荧光素，氧化荧光素能释放与 ATP量成正比的可见光信号）及三磷酸腺苷双磷酸酶（降解未参入新链的 dNTP及 ATP，猝灭荧光）。 在测序过程中，每次加入一种类型的 dNTP，若该 dNTP能与模板链互补配对，则在四种酶的作用下发生一系列的反应，最终将荧光信号转换成电信号体现出来，显示为一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数成正比。 反之，当 dNTP 不能与模板链结合时，将直接被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，相应的将不会显示峰值。如下图所示： 引物设计 精彩文档 实用标准文案 焦磷酸测序的模板也是经亚硫酸盐修饰后扩增，故其引物设计原则与 BSP引物设计基本一致： 1）引物长度在 18~24碱基； 2）避免引物间互补或自身形成发卡结构 3）引物中 G/C – A/T 的分配比例相当，使 Tm在 62-65 °C 之间其主要区别在于： 1）Pyrosequencing 的一条引物的 5 端需使用 生物 素标记，以和磁珠或琼脂糖 beads 结合，另一条引物不要 标记 2）由于游离的生物素将会和生物素标记的 PCR产物竞争 结合联霉亲和素（ beads）而降低信号水平，须使用 HPLC 纯化生物素标记的引物 。 3）要确保 PCR产物目标量大，且 没有非特异性条带 ，也 没有引物二聚体 。PCR完成后使用电泳鉴定 PCR产物。 4）PCR循环数须足够，以保证完全消耗掉引物。 Pyrosequencing 的引物设计可以直接使用 PyroMark Assay Design 2.0 软件进行设计。使用该软件时，只需将目的基因序列输入，该软件便可自动 设计反应需要的引物，并会将 CpG位点一一罗列出来，与常用的引物设计软 件一样，也会有一个评分，建议使用评分在九十分以上的引物，当最高得分 仍较低时，可考虑将 BSR引物的其中一条进行生物素标记后使用。 PS ： PyroMark Assay Design 2.0 软件对目的基因的片段长度有限制，建议 PCR的目的片段控制在 300bp 以内，测序片段控制在 100bp，这样得到的结果会更加准确可靠。 精彩文档