细胞划痕实验指导.pdfVIP

细胞划痕 细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用枪头或其他硬物在中 央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无 细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。其意义在于：价格低廉，操作简单， 还有很重要的一点在于细胞外围环境简单、单纯，容易控制，是肿瘤细胞最基本的研究方法。 一、实验前准备 实验开始前，将离心管、吸管筒、移液枪、枪头，直尺等放入无菌超净工作台，以紫外 线照射30min 。然后，采用通风机通风3min 。 取出无菌6 孔板，用黑色记号笔在6 孔板底部，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔 0.5~1cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过3 条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察 点，这样一方面便于观察另一方面可以一次取多个观察点，最终可以获得多个数据。 画好横线后，在板上分别做好标记。 取下试剂瓶和离心管上的封口膜，且将每个试剂瓶和离心管拧松，方便后续试验的操作。 二、细胞准备 取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS 清洗细胞。加入1ml 胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收 集细胞悬液于 15ml 离心管中，800rpm/min 室温离心5min 。用罗氏CASY 快速细胞计数及 5 活率分析仪进行细胞计数，弃去上清，加入培养基重悬细胞。，以每孔1~4×10 细胞的密度 接种到6 孔培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养一天。具体数量因细胞种 类不同而不同，掌握为过夜能铺满。 三、直线划痕 取出铺满六孔板的细胞，用200ul 枪头垂直于细胞表面，由孔一端划向另一端。尽量垂 直于背面的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈 #字形划痕。 四、PBS 清洗细胞及培养 吸掉旧培养基，用无菌PBS 洗细胞表面3 次，去除划下的细胞，加入含有1%胎牛血清 的培养基为阴性对照，及含有相应浓度药物的1%胎牛血清培养基为药物刺激组；每组2 个 复孔。 轻轻摇动六孔板，使药物与细胞培养液充分混合，放入37 度，5%C02 培养箱中培养。 五、结果观察 分别取划痕0 小时、24hr、48hr 后观察不同处理组的痕道宽度。 结果可见：细胞划痕后48h 观察到对照组细胞划痕宽度恢复约 90 ％，而药物抑制组恢 复约60 ％。 表明加入药物后，由于药物的作用，使细胞迁移受到抑制，而未加入药物的细胞保持原 有的迁移能力，在48h 后通过迁移将划痕掩盖。 六、注意事项 1、细胞密度 注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种密度，对不同的细胞要观察其贴壁率等，保证 培养终止时密度适当。 2、冲洗细胞缓慢轻柔 在用 PBS 缓冲液冲洗时，注意贴壁缓慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照 结果。 3、低浓度或无血清培养 划痕 PBS 冲洗后应该加入无血清培养基或者低浓度血清培养基，以排除细胞本身增殖 对实验的影响。