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细胞增殖实验(Brdu 法) 1.将盖玻片放入到24 孔板中，将长满的大盘细胞用胰酶消化后，按 1-2 万个细胞/孔加入 到24 孔板中。 2.待细胞长至50%-60%的密度后，更换培养液，导入相应质粒，4-6 小时后更换培养液。 3.培养24h 后，于每孔板加入 10µm 的Brdu，继续培养4h。 4. 4％冷的多聚甲醛固定20 分钟，PBS 洗三遍。 5. 0.2％Triton X －100 通透 10 分钟，PBS 洗三遍。 6. 按1:1000 稀释Brdu 抗体，于每孔中加300µl，4 度过夜后，PBS 洗三遍。 7. 0.5ug/ml DAPI 染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。 细胞爬片 4%多聚甲醛固定20min （固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮） PBS 漂洗3×5min 0.5%Triton 穿孔15min (丙酮固定法不用透化处理) PBS 漂洗3×5min 加入5%BSA 稀释的Brdu，于4℃杂交过夜 PBS 漂洗3×5min 10ug/ml DAPI 染色2min 抗淬灭封片剂封片 1.将盖玻片放入到24 孔板中，将长满的大盘细胞用胰酶消化后，按 1-2 万个细胞/孔加入 到24 孔板中。 2.待细胞长至50%-60%的密度后，取出细胞爬片， 3. 4％冷的多聚甲醛固定20 分钟，PBS 洗两遍。 4. 2N HCL in PBS(1:5 用PBS 稀释盐酸) 室温10 分钟 5. neutralize by incubating the samples in borate buffer (0.1 M) for 10 min at room temperature. 硼酸中和， PBS 3 次 4. Blocking buffer (5% BSA, PBS, Tween-20 0.2%)。 Goat serum 10% 5. Blocking buffer 封闭 （5%BSA）1 小时 6. BrdU(rat)/Cdk5(rabbit) 一抗4 度过夜，PBS 洗三遍。 7.二抗室温2 小时（避光），或者37 度 1 半小时，PBS 洗三遍。 （一抗，二抗稀释到blocking buffer） Dip the cover silp into DD-H20, and air-dry in filter-paper. 8. Anti-fade with DAPI,put the coversilp up-side down,然后直接照荧光片。 9.指甲油封片子的四周。