细胞因子的ELISA方法检测.docVIP

实验报告 实验名称 细胞因子的ELISA方法检测 实验日期 院 系 医学院 专 业 医检 班 级 姓 名 学 号 一、实验目的 掌握ELISA法的基本步骤和原理。 二、实验器材 试剂： 酶标抗体、底物A、底物B、终止液、2000pg/ml PGFβ1标准品、待测标本1、待测标本2 器材： 酶标架、已包被抗体的酶标条、封口膜、洗涤液、微量加样枪、酶标仪 三、实验原理 1.细胞因子测定的3类主要方法： 1）生物学方法：测细胞因子具有的生物学活性；代表实际活性，方法繁复、其它细胞因子干扰。 2）免疫学方法：细胞因子作为抗原被测定浓度；简便灵敏，不等于实际活性。 3）分子生物学方法：测细胞因子mRNA水平，间接反映浓度；较简便更灵敏，不等于实际活性和浓度。 2. 三类方法各有优缺点： 以免疫学方法较为简便和常用。免疫学方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)放射免疫测定法(RIA)等，而酶联免疫斑点法(ELISPOT)则可用于检测单个细胞的细胞因子产生情况。 3. 酶联免疫吸附剂测定（ enzymelinked immunosorbentassay，ELISA ）的基本原理是： ——双抗夹心法 1）包被：将细胞因子抗体吸附在酶标板表面，形成固相抗体。 2）用封闭液中的蛋白如牛血清白蛋白封闭酶标板表面剩余的吸附位点。以避免对后续测定中抗原抗体的非特异性吸附。 3）加入被测标本进行孵育，则其中的被测细胞因子就与固相上的抗体发生特异性结合，不发生结合的其他成分可通过洗涤去除。 4）加入辣根过氧化物酶HRP标记的抗细胞因子抗体进行孵育，则酶标抗体也与细胞因子发生特异性结合。被结合的酶标抗体的数量与细胞因子的浓度成正比。 5）洗涤去除多余的酶标抗体，再加入酶催化的底物，在酶的催化下，底物形成有色产物。 6）作用一定时间后，终止酶促反应。测定产物颜色，可以反应酶浓度高低，间接反映被测细胞因子的浓度。通过已知标准样品的对照，就可以推算出待测细胞因子的浓度。 四、实验过程及步骤 1.取已包被抗体并完成封闭的酶标条2条，分别装于酶标架上。在每条酶标条的1~6孔分别加入稀释液100微升。 2.向第6、7孔加入分别加入2000pg/ml PGFβ1标准品100微升。 3.用加样枪吹吸混匀第6孔的液体，注意避免气泡形成。混匀后其浓度约为1000pg/ml。 4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混匀。其浓度变为500pg/ml。以此类推，一直加到第2孔。吸去多余的100微升。 5.向第8、9孔各加入100微升样品1。10、11孔加入100微升样品2. 6.封口膜覆盖酶标板，防止水分挥发。 7.将酶标板置于37℃温箱孵育120min。 8.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体，注意甩动方向，避免液体流入相邻酶标孔，造成交叉污染。 9.加入洗涤液，注意不要溢出至相邻孔，造成交叉污染。静置3min后甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 10.每个孔各加入酶标记抗体100微升。封口膜覆盖酶标板，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。 11. 取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体。再加入洗涤液，静置3min后，甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 12. 每个孔各加入底物A 100微升，再加入底物B各100微升。晃动酶标板混匀。将酶标板放入37℃温箱孵育15min显色。 13. 取出孵育后的酶标板，见酶标板孔中液体呈蓝色。 14. 每个孔各加入终止液100微升，可见液体变成淡黄色。 15.用酶标仪在450nm处测OD值。结果如下： 16. 分析结果： 将2组标准品的OD值和标本1、标本2的4个副本的OD值合并得到平均值。根据各自的OD值，在半对数坐标上标出62.5、125、250、500、1000、2000这6个不同稀释度标准品所处的位置，将6个点连线集会成标准曲线。 根据2个标本的OD值标出其在OD值普通坐标上的位置，虚线连接其在标准曲线上的位置，再用虚线连接确定其在浓度坐标上的位置。推算出浓度分别为300pg/ml和400pg/ml。 五、实验总结 注意事项： 1.实验过程简单但是要注意细节，加样小心，避免交叉污染。 2. 六、教师评价