ctDNA检测关键技术.docVIP

ctDNA检测技术 循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)起源于肿瘤细胞凋亡、坏死或分泌产生DNA片段，是循周游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)一部分[1]。ctDNA含有和其起源肿瘤DNA一样基因缺点，如点突变，重排，扩增等[2]；其在血液中半衰期短，可实时反应肿瘤动态改变[3];作为液体活检一个，可克服组织活检中因为肿瘤异质性带来缺点，检测更全方面[4],所以ctDNA检测可用于癌症早期诊疗和癌症分期、肿瘤疗效评定、复发监测和预后判定等[5]。由ctDNA质量和数量改变大, 所以需要高特异性和高灵敏度检测方法。现在常见方法有数字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead, emulsion,amplification and magnetic)、高通量测序(next generation sequencing, NGS)、ARMS等[6]。 1.数字PCR 1999年Vogelstein等提出了数字PCR(digtal PCR,dPCR)概念[7]。数字PCR包含两部分，即PCR 扩增和荧光信号分析。先将是样品稀释后分配到大量微小反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝目标分子,然后分别对目标分子进行扩增，扩增结束后对每个反应单元荧光信号进行采集。数字PCR采取直接计数方法进行定量分析, 有荧光信号反应单元中最少包含一个拷贝目标分子，记为1，无荧光信号则即为0，理论上，在样品中极限稀释情况下，有荧光信号反应单元数目等于目标DNA 分子拷贝数。不过有反应单元中可能包含两个或两个以上目标分子，这时需要用泊松概率分布公式进行计算[8]。不一样于传统qPCR技术,数字PCR 不受扩增曲线循环阈值(CT) 和扩增效率影响，无需参考，正确性和反复性好，可实现绝对定量分析[9]。 依据反应单元类型不一样，数字PCR分为三类: 微反应室/ 孔板数字PCR、微流控芯片和微滴数字PCR系统。微反应室/孔板数字PCR借助高通量自动上样设备和增加反应单元数,实现快速正确取样，提升检测灵敏度。微流控芯片技术是一个基于含有数千个超高密度亲疏水微孔芯片dPCR平台，可实现高通量、低成本分析。微滴数字PCＲ( droplet digital PCＲ,ddPCR)是将含有目标分子样品分成成千上万个纳升级油包水微滴，再对每个微滴进行扩增，和荧光信号采集，更轻易实现小体积和高通量[10]。 数字PCR可绝对定量，是现在灵敏度最高检测技术，但其也存在一定缺点，如生成微滴必需服从泊松分布，所以不适合高浓度DNA样本检测，；只能检测已知突变且一次只能检测一个突变[11,12]。 2.BEAMing技术 BEAMing技术在检测ctDNA内体肿瘤突变含有很高灵敏度，它是结合了数字PCR和流式技术一个检测方法，最早是由Bert Vogelstein提出。其方法是每一类DNA分子全部会专一和磁性珠相连接，然后DNA分子之间差异能够经过流式细胞仪检测荧光标识来做出评定。这种方法是基于小珠(Bead)、乳浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性(Magnetic)，这四个关键组分来构建，所以被称作为BEAMing[13]。 BEAMing 技术过程包含：首先是分离和纯化血浆中DNA；接着是预扩增步骤，经过使用常规PCR 扩增目标基因片段，使用引物和已知标识序列混合；然后，这些DNA 模板再经过乳液PCR 扩增，应用引物探测这些序列，经过链酶亲和素磁珠相互作用和有磁性微胶珠结合。经过这种方法设计系统，在反应结束之前，每个乳液液滴中生成PCR 产物将保持对微胶珠附着性，使其能够很轻易地经过磁性进行分离和纯化[14]。而且，BEAMing技术是利用磁珠来吸附游离DNA，它能够从1万个健康细胞DNA中检测出那一个ctDNA分子，含有较高敏感性，同时在很多研究中其在肿瘤组织中发觉突变全部和ctDNA部分突变是一致[15,16]。 BEAMing技术相比其它检测技术含有很多优势：（一）在常规试验室条件下，数以万计DNA分子能够经过该种方法来进行评定。（二）特异突变能够经过流式细胞仪进行分离筛选以备深入分析和研究。（三）BEAMing技术能够用来对特定组织或人群中罕见突变，和研究通常基因序列或转录产物变异全部能够提供对应判别和定量分析。因为外周血流中ctDNA 拷贝数量是很低，尤其是相较于野生型DNA 来说。出于这个原因，使用PCR 进行DNA 扩增是BEAMing 过程中一个关键部分，是确保可靠检测确保[5]。 然而，BEAMing 这项检测技术只能检测已知突变，且成本较高[17] 同时，它操作也较复杂，通量低，且单分子扩增在非均一微滴中实现