分子医学技能：实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA制备.pptVIP

分子医学技能实验 实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA制备 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。 是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤。 一、基因组DNA的提取与纯化 目的： 核酸分离纯化的总原则： ? 保证核酸一级结构完整 ? 排除其它分子的污染： 细胞内：蛋白质、脂类、糖、RNA等 提取过程中：有机熔剂、金属离子、外源DNA 细胞样品的核酸提取的主要步骤 破碎细胞 去除细胞内的其它分子： 蛋白质 多糖 脂类 去除盐类、有机溶剂等杂质 核酸提取注意事项 减少化学因素对核酸的降解 如过量酸碱 减少物理因素对核酸的降解 机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 高温 防止核酸的生物降解 核酸酶的预防 二、人基因组DNA的制备 实验目的及意义： 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA 掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理 分离纯化基因组DNA的常用方法： 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，因此它们有共同的步骤： 裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶 除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质； 析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 实验材料及试剂 材料：人口腔上皮细胞 试剂： 抽提缓冲液：Tris-Cl pH8.0 ，EDTA，NaCl， RNAase， SDS，蛋白酶K 水饱和酚 氯仿/异戊醇（V/V=24:1） 75%乙醇、95%乙醇 TE缓冲液：Tris，EDTA 主要试剂的功能 抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成 SDS的作用是裂解细胞 EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对DNA分子的降解作用。 蛋白酶K的作用是水解蛋白质。 酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质 乙醇：沉淀DNA TE：溶解DNA 取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，用15ml离心管（4000rpm ? 10min）收集细胞沉淀 （离心机的使用，平衡）? 加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至1.5ml EP管 （微量移液器的正确使用） 混匀，65℃ 温育30min ? 加入等体积的【饱和酚(~0.25ml)：氯仿/异戊醇(~0.25ml)】 充分颠倒混匀 （不要剧烈震荡！） P13 实验步骤及注意事项（一人一组）： 12000rpm?5min，上层水相转移至新的EP管 （高速离心机的使用与安全意识）? 加入等体积【氯仿/异戊醇】，颠倒混匀 12000rpm?5min，上层水相转移到新的EP管 ? ? 加入2倍体积95%的乙醇，颠倒混匀 12000rpm?10min ? 弃上清，沉淀中加入75%乙醇 ? 12000rpm?2min ? 轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置5~10min 加入30-50 ?l 0.1×TE溶液，充分混匀后检测结果? 分子医学实验注意事项 微量移液器的正确使用 离心机的正确使用 上课纪律 撰写实验报告的规范 实验结果及其分析 ? 定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳 ? apoB基因多态性分析 下次实验课进行 常见问题：  1、提取的DNA不纯： 变性不充分；关键过程反应时间过短； 离心时间或速度不够。 2、提取的DNA成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴； 操作系统有污染。 3、与细胞器DNA分离不全； 变性过程不完全； 试剂配置问题。 实验报告格式 实验目的和应用价值 实验原理 实验基本流程和注意事项 实验结果和讨论 总结或感想 课后作业与实验报告分开