分子生物学-10-3-第五章基因文库1-概念和步骤.docVIP

PAGE 郜刚分子生物学教案 教学内容与教学设计：（续上节） 绝大多数基因难以直接分离得到 高等真核生物，基因组DNA十分庞大 基因可达数万个 基因组成结构复杂 编码序列、非编码序列、调控序列、间隔序列、重复序列 单个目的基因在整个基因组中所占比例极小 未知基因更难克隆 要分离的目的基因往往是未知基因 无法对它进行特异性扩增， 只能对所有的基因进行扩增，构建基因文库 然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来 最后分离得到目的基因。 5.2.5 1、概念 又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落(或噬菌体)的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 基因文库包括基因组DNA文库和cDNA文库 基因组DNA文库(genomic DNA library)：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库 从特定组织提取的染色体基因组DNA，其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因，研究基因组成 cDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。 从特定组织mRNA反转录成的cDNA拷贝，其目的是分离某一特定器官在特定发育时期细胞内的mRNA，研究基因表达 2、基因文库构建的一般程序 3、基因组DNA文库的类型 质粒文库 噬菌体文库 粘粒文库 人工染色体文库 （细菌人工染色体文库、 酵母人工染色体文库） 人工染色体载体 人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统，包括YAC、BAC、PAC、MAC和HAEC。 染色体基本功能单位包括复制起始点(replication origin)、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。复制起始点，保证了染色体复制，着丝粒保证了染色体分离，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在。 BAC和PAC是用于原核生物大肠杆菌内的人工染色体。 BAC是以细菌大肠杆菌F因子(fetility factor)为基础构建的环形质粒，容量为～300kb， PAC则以P1噬菌体(P1 phage)和F因子为基础构建的环形质粒，容量为130-150kb。它们不是严格意义上的人工染色体，因为它们不含着丝粒和端粒。 YAC是酵母人工染色体，它含有着丝粒，复制原点和端粒，能稳定遗传，其容量在100-2000kb。在染色体区带构建YAC重叠群，促进了大规模基因组测序和致病基因的克隆。 MAC哺乳动物染色体基本功能单位。如果研究成功，可能成为很好的基因治疗载体和转基因动物载体。 HAEC是基于人类EB病毒而构建的环形DNA，含有EB病毒的复制原点(oriP)和潮霉素抗性基因。能以环形小染色体形式复制，并在有丝分裂中保持稳定。HAEC可能会成为基因治疗的重要载体。 4、基因组DNA文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸载 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选等后续操作 5、计算文库规模的公式 计算完全基因文库所需实际克隆数的公式N=ln(1-p)/ln(1-f) 式中，N是 所需克隆数；P为重组体群体中出现目的基因序列的几率；f为限制片段的平均大小与基因组DNA总量之比。例：大肠杆菌基因组大小为4.6×106bp,所克隆基因组DNA片段的大小为2 ×104bp，为使目的基因存在库中的概率为99%，该基因文库含有重组体克隆数应大于多少？? ? 解：N=ln (1-99%) / ln [1-(2 ×104bp/ 4.6×106bp)]=1.1 ×103 6、基因组DNA文库构建的程序 ① 载体DNA的制备； ② 高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备； ③ 高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑选和保存。 7、基因组DNA文库的保存 滤膜影印保存法-已经不常用 文库在液体培养基中扩增保存 方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后