分子医学技能：免疫印迹.pptVIP

中山大学中山医学院免疫学教研室 免疫印迹 Immunoblotting 印迹技术 印迹技术是将生物大分子物质（核酸或蛋白质）通过不同的途径转移到固相载体上，然后与相应的探针发生化学或免疫学反应，显示谱带的一种方法。 分类： Southern Blot: 分析DNA Northern Blot: 分析RNA Western Blot:分析蛋白质, 是将凝胶电泳与固相免疫相结合的一种复合免疫技术,又称免疫印迹。 实验原理 通过SDS将抗原按其分子量大小分离； 转移到固相支持载体（硝酸纤维膜）上； 封闭空白位点； 再与抗体共孵育后，特异性抗体与抗原结合形成免疫复合物； 用酶标抗体作为示踪二抗； 加入能形成不溶性显色物的酶底物，使目的条带显色，对抗原进行鉴定。 转膜装置示意图 电极 膜 胶 滤纸 转移槽 免疫印迹 优 点： 同时具有SDS的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性； 方法简便； 标本可长期保存； 结果便于比较。 实验流程 实验方法 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （已完成） 蛋白质从SDS凝胶转移至硝纤膜 （已完成） 封闭硝纤膜的免疫球蛋白结合位点 （操作内容） 酶标抗体结合与染色 （操作内容） 实验材料 NC膜 1条/组 5％脱脂奶粉 1ml/组 一抗溶液 1ml/组 酶标抗体 1ml/组 PBS 10ml/组 小镊子 1支/组 底物显色液 10ml/班 操作步骤 1.封闭：把NC膜（已转印）放入小试管中，加入5％脱脂奶粉1ml，塞上小胶塞，室温下温育15－20分钟，期间注意缓慢摇动数次。 2.打开胶塞，弃去封闭液，立即加入一抗溶液与滤膜一同温育30分钟。 3.弃去液体，加PBS（2-3 ml）漂洗2次，每次1分钟。 4.加入1ml酶标二抗，37℃30分钟，不时摇动。 5.弃去液体，加入PBS（2-3ml）漂洗3次以上，每次1分钟。 6.加入底物DAB覆盖NC膜，避光显色5-10分钟。 7.分析结果。 操作步骤 结果图例 两种细胞在扁蒴藤素刺激后不同时间点凋亡通路相关蛋白表达差异的比较 谢 谢！ 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 * 将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)或非变性电泳(Native)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面， SDS PAGE:在缓冲液中添加 SDS 的电泳系统称为 SDS(十二烷基硫酸钠〔皮肤清洁药〕) 胶片电泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 简称 SDS). SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白质的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 然后用蛋白溶液（如10％的BSA）处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。 处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。 印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。 然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如，将经SDS分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应，加