药物代谢动物实验基本操作的注意事项.pptVIP

C)2013年4月 seminar 药物代谢研究中的实验方法, 基础操作及注意事项 汇报人: 汇报日期:2013-4-12  药物代谢的基本概况 动物实验的基本操作及注意事项 生物样品的前处理  义的药物代谢 A DME 吸收 分布 代谢 排泄 Absorption Distribution Metabolism Excretion  药物代谢-生物转化 相代谢 氧化,还原,水解反应 cYP450酶 二相代谢 内源性物质结合反应 UGTS, SULTS, NAT, GST, MT  药物代谢研究方法 体内代谢法 体外代谢法 考虑各种体内 方便控制代谢条件,代谢 够真实全面 勿代谢的体内整体特 定药物代谢途径及结构 物在生物体内的 的结构确定 转化的器官和 但不能全面反映体内 的浓 度低 谢情况存在  体外代谢主要方法 有肝微粒体温孵法肝细胞体外温孵法 体外肝脏肝脏灌流技术 肝组织切片法 代谢 基因重组酶系 微透析技术 体外肠菌粪便温孵法单一菌种温孵法 代谢 肠菌酶法  6体外体系 优点 缺点 肝微体原材料易得;易于制备和保存:实验侧备过程中会失大量胞溶酵 成本低而且重复性好;可以药物候导独Ⅱ相代谢能力的缺失;不具备完整的 选物进行体外大规模筛选 细胞结构:一些代谢酶丢失:孵育体系雷 要加辅助因子。 新鲜或冷具备完整的细胞结构:代谢破坏性 未源有限,不能随时获 冻的听细小;代谢酶成分和活性与体内相似,制各过程复杂;不容易保存和豆复利用 被认为是药物体外代谢研究中的 “金标准” 每次制备的肝细胞可能活性差异较大 实验重复性不好且成本高。 水生材料随时可得:培养相对容易:细胞 细胞色素P450的表达非常低 肝组脆系内代晓酶活性均一,实验重复性好,与正常肝细胞在银多方面具有巨大差异 肝切片保留了肝脏中参与药物代明过程的几化合物很难扩散到切片组织内部, 乎所有成分,与体内生理情况较接近 测得的清除速率可能较低 重组表达代谢酶成分比较纯,容易找到代谢某表达步骤比较麻烦:制备时间较长 酶体系 个化合物的代谢同工酶 成本较高  肝微粒体的制备 差速离心法 CaCl2沉淀法 制备肝微粒体 通过高速离心 即在离心前额外加 使微粒体与其他成 CaCl2,促进微粒 分分离,操作简单 的聚集和沉降。这种 无需其他试剂辅助 方法对设备要求降低 但需要的时 而且缩短了实验所需 对设备的整体要求 的时间,是研究药物 体外代谢,制备微粒 体的常用方法。  )肝微粒体 孵育体系:药物+缓冲盐+含不同供体的辅因子体系 肝微粒体体外I相启动反应 NADPH 代谢溫孵法 肝微粒体体外葡萄 糖醛酸结合代谢温月动反应 UDPGA 孵法 肝微粒体体外硫酸启动反应pAPS 结合代谢溫孵法  肝微粒体酶制备10000转专的超高速离心机,目前 实验室还没有条件。有直接买肝微粒体来做体外 代谢实验的,但是体外实验酶活性很难控制,酶 容易失活。一般在体外实验中要设立阳性对照组, 来反应酶的活力。 体外孵育是很好的累积代谢产物的方法。在代谢 产物的分离和结构鉴定方面有应用价值。可以直 接用肝匀浆液和肠内容体外孵育来制备代谢产物。 在实验过程中要冰浴,快速,尽量确保酶的活性。