辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体.pdfVIP

。 辛酸 - 硫酸铵法纯化单克隆抗体 辛酸 - 硫酸铵法纯化单克隆抗体 ( 一) 原理 蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成 水化膜的程度 , 以及蛋白质分子带有的电荷。如改变这两个因素 , 蛋白质就容 易沉淀折出。 引起蛋白质沉淀的主要方法有 (1) 盐析 , 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出 , 沉 淀不同蛋白质所需盐浓度及 pH 值不同 ; (2) 生物碱以及某些酸类 , 在 pH 值小于等 电点时可以与蛋白质形成不 溶的盐使其沉淀 ; (3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等 , 在 pH 值大于等电点时可以与蛋白 质结合成不溶的盐使其沉淀 ; (4) 有机溶剂如酒精、 甲醇、丙酮等 , 对水的亲和力很大 , 能破坏蛋白 质水化膜 , 在等电点时使蛋白质沉淀。 辛酸 (caprylic acid) 在偏酸条件下 能与血清或腹水中除 IgG 外的其他蛋白质结合 并将其沉淀下来 ,IgG 则溶于上 清液中 , 再用硫酸镀盐析 , 即可达到纯化 IgG 的目的。 辛酸 - 硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法 , 利用该 方法纯化单克 隆抗体 , 回收率和纯度都可达 80% 以上。 ( 二) 试剂和器材 1. 试剂 (1) 小鼠腹水。 (2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。称 (NH4)2S04(AR)400~425 克 , 以 50 ℃ ~80 ℃蒸馆水 500ml 溶解 , 搅拌 2O min, 趁热过滤。冷却后以浓氨水 (15M NH40H) 调 pH 值至 7.4 。配制好的饱和硫酸铵 , 瓶底应有结晶析出。 (3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。 贮存液 : A 液 ,0.06M NaAc: 无水 NaAc0.49218g 加蒸馆水至 100ml 精选资料，欢迎下载 。 B 液 ,0.06M HAc: 冰醋酸 0.344ml 加蒸馆水至 100ml 应用液 : 取上述 A 液 59ml 与 B 液 41ml 昆合 , 用 5M NaOH 调 pH 值 至 4.80. (4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液 (PBS). 取 Na2HP04 ·12H2028.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至 100Om1 (5) 含 137mMNaCl 2.6mMKCl 0.2mMEDTA的 pH 7.4 磷酸盐缓冲液 (PBS): 取 Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、 KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至 100Oml 2. 器材 普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器 , 紫外分光光度计、天平 ; 透 析袋、塑料夹、精密 pH 试纸 ; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。 （三) 操作步骤 方案一 ( 硫酸铵沉淀法 ) 1. 腹水 4 ℃ 12000 rpm 离心 15min, 去除杂质。 2. 取 1 份腹水与 2 份醋酸盐缓冲液混合 , 室温搅拌下逐滴加入正辛酸 33 μ l/ml 腹水。