RNA提取中各种试剂的作用[学习].pdfVIP

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA 时，氯仿可以有效的使有机 相和无机相迅速分离。RNA 提取过程，有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使 得蛋白和RNA 脱离，RNA 进入水相。 氯仿的作用有多个方面，加入氯仿，虽然有变性蛋白质的作用，但是其主 要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。一般的trizol试剂在4 度下是油状悬浮液，提高温度，放置一段时间，自然也会分相。离心后混合物 分成三层：下层苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存 在于水样层当中。水样层的容量大约为400ul 。 【标准：1mlTrizol加200ul 的氯仿， 水样层的容量大约为所加Trizol 容量的60% 】 上层水相，PH 5.1 左右，当溶液pH 在酸性的时候，RNA 分子就会沉淀在 酚与溶液的界面，只有RNA 分子留在水相。而当pH 接近中性时，RNA 就会 溶解在水相，（导致PH 中性的大概原因是trizol 与样品比例不对，应该尽量保 证提取量的前提下使trizol 过量） Trizol 法提RNA ，加氯仿就是要剧烈震荡才行，这样才能彻底地两相混匀。 异丙醇的作用是通 -OH的疏水作用使得RNA链中的亲水基团受到保护， 等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。通过将 水样层和异丙醇混合来沉淀RNA ， RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶 状片状沉淀附着于试管壁和管底。 异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V~1V 就 够了，在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇 沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。【400ul 的水 相对应500ul 的的异丙醇。】 醇沉淀是很经常用的方法，因为RNA 和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以 用来沉淀。乙醇沉淀的主要目的是沉淀+除盐。 TRIzol 主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时， 保护ＲＮＡ的完整性 。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA 存 在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通 异丙醇沉淀来还原。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，TRIzol 法对少量的组织(50-100 mg)和 细胞(5 ×106)以及大量的组织( ≥1 g)和细胞(107)均有较好的分离效果。 TRIZOL 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一 小时内完成。TRIZOL 抽提的总RNA 能够避免DNA 和蛋白的污染。故而能够 作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA 酶保护分析和 分子克隆。 提取时需要注意一些问题：提取时要做到超净台内操作、操作带一次性手套、 EP 管及Tip 头都要用0.1%处理（0.1%DEPC 浸泡过夜后，高压蒸气灭菌）、小 心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的唯一目的就是两个，一是小心 RNAse 的污染降解RNA ；二是动作过度暴力破坏RNA 的完整性。 另外你提的RNA 做电泳的问题，一般RNA 电泳应该是做甲醛变性电泳， 但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短 越好（这样也是为了减少外界RNAse 对RNA 的降解），跑完电泳立刻观察，这 样也可以，但是如果样品中的RNA 量很低或者说不是很高的话是检测不到的。 因为这些试剂都会影响后续实验,所以用酒精洗一到两遍.一是酒精可以溶解 一些沉淀中可能的有机物杂质,二是洗掉异丙醇,氯仿试剂,酒精的易挥发性 在这 里的到运用, 最后的乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，痕量的乙醇很容 易挥发掉。