蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法(实验报告).docxVIP

蛋白质浓度测定一一考马斯亮蓝染色法 （实验报告） 实验日期：2015年4月28日 实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室 指导老师:二 班级:2013级生物技术 1班 姓名:** 学号:******** 实验目的 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法； 熟悉蛋白质含虽测定的影响因素。 实验原理 考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的， 这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的 方法。 考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸 收波长465nm,与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长 595nm,在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含虽成 正比。 蛋白质与考马斯亮蓝 G-250结合，反应2min即可到达 平衡，复合物在室温下 1h内保持稳定。蛋白质一考马斯亮 蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度 很高，可测微克级蛋白质含虽。 实验试剂与仪器 实验试剂 ⑴100 p g/mL标准蛋白质溶液 5mg酪蛋白溶于50mL 的0.1mol/L氢氧化钠溶液 。 考马斯亮蓝 G-250试剂 50mg考马斯亮蓝 G-250溶 于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL ,蒸［留水定容 至 500mL。 正常人血浆。 实验器材 可见分光光度计，100 微虽移液器16支，5mL刻度 吸管8支，中试管。 IV.实验操作步骤 mL 0 1 2 3 4 5 样品1 样品2 标准蛋白质溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - - 血浆 0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.4 0.4 0.1mol/LNaOH - - - - - - 0.6 0.6 考马斯亮蓝试剂 各5.0 1.绘制标准曲线 取中试管8支，按下表加入各种试剂 混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白, 记录于下表，绘制标准曲线 标准曲线绘制数据表 0 1 2 3 4 5 样1 样2 标准蛋白四数 0 A595 0 0.517 0.805 0.941 1.157 1.192 1.465 1.440 样品测定 中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人 正常血浆）0.4mL,各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温 放置5min ,以“ 0”号管为空白比色，以所测 A595于标准曲 线查蛋白质含虽。 V.实验结果分析 1. 4 1,2 1 g官 5 0.4 标准曲线 ,1 1 A 9 1 ?0. 941 ? AE95 0 1 1 1 1 一 20 co 翩董白画 to 100 120 结果分析：实验未能达到预期的一条直线， 原因可能为: ①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于 使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作 不当，导致误差。 VI.注意事项 1.考马斯亮蓝试剂加入后室温放置 5?20min内比色， 布的超过1h; 2.蛋白质-染料复合物少虽附于比色杯，不影响测定, 可用乙醇洗净。