酵母单杂交实验步骤总结.pdfVIP

1 pBait-AbAi 载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（ pBait-AbAi ）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝， r 且插入到 pAbAi 载体 AbAi 报告基因的上游。 大量研究表明最有效的构建应包含 目的 DNA 三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于 长度小于 20 bp 的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1） 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列， 且两端加上与 pAbAi 载体酶切产物一致的粘性末端 （建议合成一个目的序列的突变序列 作为对照，以排除可能的假阳性） 。 （2） 用 TE buffer 溶解寡核苷酸至终浓度 100 mol/L 。 （3） 将正向链和反向链按照 1:1 的比例混合 （退火后的双链寡核苷酸最大浓度 为 50 mol/L ）。 （4） 95 C 保温 30 s，去除二级结构。 （5） 72 C 保温 2 min ，37 C 保温