冰冻切片免疫组化步骤.docx

冰冻切片免疫组化步骤 需要准备的材料 APES 包被的载玻片 PBS（ pH7.4） 4%多聚甲醛 PBST（含 Tween-20）PBST-G（含 0.3mol/L 甘氨酸） 冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内， 之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内） ，大约 10-20 秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于 -80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度 4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用 APES 包被的载玻片， 以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。 免疫组化染色步骤 固定：取出切片，室温放置 5mins。用 4%的多聚甲醛 PBS 溶液室温固定15mins，PBS 冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃） 。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（ TritonX-100 ）打孔：组织样品浸于含 0.25% TritonX-100 的 PBS 中 10mins，之后用 PBS 洗 3 次，每次 5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含 1%BSA 的 PBST 溶液中 30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本， 在封闭缓冲液中加入 0.3mol/L 的甘氨酸。 孵化：组织样本浸于一抗（用含 1%BSA 的 PBST 稀释），放于湿盒中，室 1h 或 4℃过夜。用 PBS 洗 3 次，每次 5mins。 浸入二抗（ 1%BSA 的 PBST 溶液），室温 1h。PBS 洗 3 次，每次 5mins。 染色：浸入 0.1-1ug/mL 的 DAPI 或 Hoechst 中，染色 1min，PBS 淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与 4 或-20℃。