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〈〈环境监测》开放实验指导书 河北科技大学 环境科学与工程学院 BOD专感器微生物固定化膜制备 、实验目的 （一） 掌握微生物的培养方法 （二） 了解微生物的固定化方法 （三） 熟练掌握BODM定的传感器方法 二、实验原理 生物化学需氧量（Biochemical Oxygen Demand，简称 BOD）是利用好氧微 生物在分解水中有机物的生物化学氧化过程中所消耗的溶解氧量来表示水体有 机污染程度的综合指标。 BOD散生物传感器一般使用固定化微生物膜作为敏感元件， 并与氧电极紧密 组合而成。将此电极置丁包温流通测量池中，当氧饱和的磷酸盐缓冲液通过流通 池时，微生物的呼吸活性是包定的即内源呼吸状态， 溶液中的溶解氧扩散进入氧 电极表面的速率达包定时，输出一个稳定电流值。加入样品后，有机物进入流通 池，膜上微生物在同化有机物的同时呼吸活性增强即外源呼吸状态， 消耗溶解氧, 其扩散进入电极表面的速率减小，输出电流值降低，几分钟内达到新的动态平■衡。 上述两种稳定电流之差，与进入流通池中的有机物浓度呈线性关系， 借此间接计 算出BO酣［5］。原理示意图见图1-1。 a外源呼吸状态 b内源呼吸状态 1、氧电极2、固定化微生物膜 3、微生物 图1-1 BOD微生物传感器原理示意图 三、仪器和试剂 （一）主要仪器 电热高压蒸汽灭菌锅 上海宜川仪表厂 振荡培养箱 江苏金坛新一佳仪器厂 德国 HERMLE-Z323离心分离机 德国 HERMLE-Z323 恒温水浴箱 Barnstead/Thermolyne Corporation in U.S.A 5. C31/1-从A型电流表 上海良标智能终端股份有限公司 6. 3066-PEN 记录仪 四川仪表厂 7. SJG-203A溶解氧分析仪 上海$磁仪器厂 8. AB204-N电子天平 Mettler-Toledo Instruments Corporation 9. FU.HUA快速混匀器 金坛市富华电器有限公司 (二)试剂 1.牛肉浸膏 生化试剂 上海长阳生化制药厂 2.葡萄糖 分析纯 石家庄市试剂厂 3.谷氨酸 分析纯 湖州生物化学厂 4.可溶性淀粉 分析纯 张家口市化学试剂厂 5.蛋白月东 细菌培养基用大五容易化学株式公社 6.辅料A 7.磷酸二氢钾 分析纯 北京益利精细化学品有限公司 8.磷酸氢二钠 分析纯 天津市河东区红岩试剂厂 9.醋酸纤维素膜 北京化工学校附届工厂 10.亲水性聚四氟乙烯膜 华怛局科工程技术(北京)有限公司 11.蒸僻水 (三)主要试剂 (1) BODB准溶液：葡萄糖溶液 150mg/L和谷氨酸溶液150mg/L的混合溶液, 称 GG酣液，其 BO叫(198 土 30.5)mg/L。 磷酸盐缓冲溶液：分别取NaHPO?12HO5.970g ,KH2PO0.4539g溶于1200ml 水中，终pH=7.78，含盐浓度为0.234% (w/v)。 四、实验步骤 (一)菌种及培养 菌种：菌种为河北科技大学环境学院生物检测技术实验室筛选、 驯化的地衣芽抱 杆菌(Bacillus licheniformis ,)。 菌种的培养基：牛肉膏0.3%,蛋白月东0.5%,葡萄糖0.5%,可溶性淀粉0.5%,加 入蒸僻水加热使之溶解,此时溶液呈澄活透明,放置使其冷却至常温,调节PH值 到7.0?7.2之间。 灭菌：将盛有液体培养基的三角瓶放入电热高压蒸汽灭菌锅中 ，升温至压力 0.1MPa,30分钟后灭菌完毕，静置至温度降低。 培养方法：将菌种用接种针在超净台上接到灭菌后的液体培养基的三角瓶中， 在 35C下培养24h,于离心分离机上离心分离得到湿菌体。用 pH=7.76的磷酸盐缓 冲溶液洗涤两次，静置2分钟，倒去上活液，称取0.5g湿菌体加1ml人工模拟海 水配制成0.5g/ml的菌悬:液。 （二）微生物的固定化及膜的制备 1、 材料选择 膜原料：膜选用醋酸纤维素膜。 粘接剂：双面胶，辅料选用硅藻土。 2、 微生物的固定化及膜的制备 在菌悬液中加入一定量的辅料硅藻土， 振荡混合均匀。用微量取液器分别吸 取一定量含硅藻土的菌悬:液滴在直径 13mm孔径0.45 [1 m的醋酸纤维素膜上， 然后用一个相同的膜覆盖上,用双面胶将两层膜边沿粘合起来。 3、 传感器的组装 将微生物膜用磷酸盐缓冲溶液润湿，紧贴于氧电极的聚四氟乙烯膜表面上， 用塑料圈固定好，组成微生物传感器。 4、 测试步骤 将膜放入盛有磷酸盐缓冲溶液和定量 GGA勺溶液，恒温（33± 1C）、不断曝 气以保证溶解氧充分，如此活化一天，就可以正常使用了。 测量时向测量池中加入50mL磷酸盐缓冲溶液中，恒温（33± 1C）、不断曝 气以保证溶解氧充分，传输其输出一恒定电流I。。此时，向测量池中加入一定体 积的GGAfe准溶液（浓