48过氧化物酶活性的测定比色法.docx

实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法） 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的 氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可 以反映某一时期植物体内代谢的变化。 一、原理 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处 有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 马铃薯块茎。 （二）试剂 1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。 2 ．反应混合液： 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ） 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 μ l ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 l ，混合均匀，保存于冰箱中。（三）仪器设备 分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管， 离心机。 三、实验步骤 1 ．称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r ／ min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上 清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。 2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为 对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开 启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。 四、结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 A 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之。也 可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。 过氧化物酶活性  （  ·  ） 式中： A 470 ——反应时间内吸光度的变化。 V T ——提取酶液总体积， mL 。 V s ——测定时取用酶液体积 , mL 。  W ——植物鲜重，  g 。 t  ——反应时间，  min  。