荧光定量PCR引物设计原则[整理].pdfVIP

1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区 5’端的 300-400bp 区 域内，可以用 DNAman,Alignment 软件 看看结果。 2. 产物不能形成二级结构（自由能小于 58.61KJ/mol ）。 3.引物长度一般在 17-25 碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C 含量在 40%~60%之间 45-55 ％最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4 个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4 个碱基的互补。 8.引物 5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开 AT,GC rich 的区域，避开T/C,A/G 连续结构（2-3 个）。 10. 引物 3′端要避开密码子的第 3 位。 11.引物整体设计自由能分布 5‘端大于 3’端，且 3‘端自由能最好小于 9KJ/mol 。 可用 oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度 80-150bp 最好，最长是 300bp. 13.引物设计避免 DNA 污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于 70 ％或者有8 个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的 DNA 序列，与需要扩增的目的片段长 度相似。 16.TM 值在 58-62 度之间。 17.引物设计的软件 Primer 5.0 有专门针对荧光的。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设 计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： ① 引物长度 一般引物长度为 18~30 碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm 值）最重要的因素就是引物的长度。有 以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于 20bp 时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于 20bp 时：62.3℃+0.41 ℃(%G-C)-500/length-5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有 少量差距。为了优化 PCR 反应，使用确保退火温度不低于 54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。 总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高 4 倍，这样，大多数应用的最短引物长度为 18 个核苷酸。 引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA 上形 成供 DNA 聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。 ② GC 含量 一般引物序列中 G+C 含量一般为 40%~60%，一对引物的GC 含量和 Tm 值应该协调。若是引物存在严重的 GC 倾向或 AT 倾向则可以在引物 5’端加适量的 A、T 或 G、C 尾巴。 ③ 退火温度 退火温度需要比解链温度低 5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR 的特 异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是 DNA 双链结合。一对引物的退火温度相差 4℃～6℃不会影响 PCR 的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在 55℃～75℃间变 化。 ④ 避免扩增模板的二级结构区域 选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结 构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G ）小于58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若 不能避开这一区域时，用 7-deaza-2’-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。 ⑤ 与靶 DNA 的错配 当被扩增的靶 DNA 序列较大的时候，一个引物就有可能与靶 DNA 的多个地方结合，造成结果中有多个条 带出现。这个时候有必要先使用 BLAST 软件进行检测，网址：/BLAST/。选 择 Align two sequences (bl2seq)，如下图。 BLAST 的使用方法也十分简单，如下图所示。 将引物序列粘贴到 1 区，将靶DNA 序列粘贴到 2 区，这两者可以互换的，并且BLAST 会计算互补、反义链 等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的 GI 号也可以直接 输入 GI 号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在 3 处点击 Align 就可以查看引物在靶 DNA 中是否有 多个同源位点了。 可是使用 BLAST