CHO细胞表达系统常见问题与解析.docxVIP

WORD格式 1、问：请问有人养过 CHO细胞吗？文献报道说用 DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低 糖？ 参考见解： CHO细胞用高糖 DMEM养就可以了，比较好养， 10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢， 跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板 上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道 pcDNA3.1 入细胞，是选 cho 细胞呢还是 hek293 细胞？ cho 细胞转染效率高吗？ 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出 问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验 之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有： 1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。 2） WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。 （ 3）构建一个 N 或 C 端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用 GFP）有可 能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。 当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个 DNA 测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用 CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长 参考见解：培养 CHO细胞最好用 F12，并且由于 F12 中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血 清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们 的前辈曾用 F12 在无血清的条件下成功的克隆出 CHO细胞。 专业资料整理 WORD格式 无血清培养 CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养 CHO细胞的无血清培养基（好 像 HyClone 就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血 清。在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是， CHO细胞先 在含 10％血清的常规培养基里培养，再到含 5％血清的培养基里培养，再到含 2.5 ％血清的培养基里培养， 依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让 CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就 是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。 4、问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入 pcDNA3.1， 没有插入其他的基因或者 tag 。现准备转染 CHO细胞。就相关问题想问问： 有的文献上没有署名 K1 或是 DHFR,普通所写的 CHO细胞是指那种？野生型 CHO细胞又是指的哪种？ 这三种细胞是不是因为 CHO-K1和 CHO/DHFR有-扩增基因 GS和 DHFR,可以更为有效的扩增进而表 达，比野生型 CHO在转染中更起作用？ 如果就我的实验要求， CHO-K1或者 CHO/DHFR更-加适合，那么转染 CHO-K1是不是可以直接转染？ 而转染 CHO-DHFR需-要和携带 DHFR-的标记质粒共转染？ 参考见解：做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一个抗性基因， 如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表 达。 1）野生型 CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１ 2） CHO－ DHFR-是指ＤＨＦＲ缺陷型细胞，ＤＨＦＲ作为筛选标记． 3）你用 pcＤＮＡ 3.1 的话 , 可以直接转染 CHO-K1,加 G418筛选即可 . 专业资料整理 WORD格式 5、问：最近作试验需要用到 CHO细胞，老师从广西带回两瓶，本来用的是 DMEM培养液，由于我没有 接触过细胞这方面的知识，上网查了下培养液，说 1640 就可以，就仓促用了 1640，两天过去了贴壁很 不好，估计是要完了，求救。 参考见解 1： （ 1）带回来的细胞瓶汇合度大概多少？一般送人的细胞汇合度大概 80－ 90％，且瓶里加满培养液，再包 装。细胞生长旺盛，便于处理。加满培养液的目的是防止运输过程中倒置，细胞接触不到培养液而死亡或 活力下降。培养时应该分瓶培养。我想你应该分瓶了吧，我们一般 1:3 分瓶。不分瓶培养可想而知了。 2）如果上述没错的话，准备好正确的完全培养液，将生长不好的细胞瓶中的细胞消化收集，合并一下，铺底大概 30％。正常培养。 3）关键掌握住起始细胞的密度和严格的操