《酶的分子修饰》.ppt

Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule;Contents of chapter 4;4.1 什么是酶分子修饰？;酶化学修饰原因;酶修饰的方向;酶分子修饰的意义;一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。;三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。;四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。;4.2 酶分子修饰的基本要求和条件 ;修饰剂的要求;酶的性质;酶分子修饰的条件;酶修饰方法选择;4.3 酶分子的修饰方法 ;(1) 酶的金属离子置换修饰;金属离子置换修饰的过程 ;金属离子置换修饰的作用：;(2) 酶的大分子修饰;用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 ;大分子修饰(共价)的过程;应用： 消除了抗原性 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） 延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran修饰?-淀粉酶，??－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。;聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。;大分子结合修饰的作用：;(3) 酶分子的侧链基团修饰;酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类别。它们的侧链基团不同，修饰方法也有所区别。;催化活性/非催化活性基团的修饰;几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应;1. 化学修饰反应的类型 ;烷基化反应; 2) 酰基化反应 试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）;酰基化反应; 3) 氧化和还原反应 试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团：二硫键。;连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。; 4) 芳香环取代反应 试剂：卤（碘）化，硝化试剂。 碘代： I2＋ ? + HI 硝化： (NO2)4C + ? +(NO2)3CH??;2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1) 氨基的化学修饰： 来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化 酰基化修饰剂: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS） 烷基化修饰剂： 2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等;; 2) 羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性较差。 常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。 + ? 水溶性碳化二亚胺 ;3)胍基的化学修饰 来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。 修饰剂：