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基因诊断技术讲义 第一节 扩增片段长度多态性 在基因组DNA序列中存在5到10万个短重复序列（short tendom repeats, STR） ，重复单元的长度不等，大 部分有很高的多态性，PCR扩增后通过电泳检测扩增片段长度多态性 （amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP），因此?STR多态性成为第二代多态性标记，在基因连锁分析中的应用越来越广泛。 重复单元较长的STR 的PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳分析，短的重复单元则需用聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylami ne gel, PAG） 电泳 分离。大部分STFT增片段可用银染法显示，崐只有扩增效率较低的位点需参入同位素，通过放射自显影检测。 短重复单元（如双核苷酸）的STFT增片段会因聚合酶滑动 （slipage）或合成中止的链再延伸，一个等位片段会产 生多种长度的扩增片段，彼此相差一个重复单元。为了便于结果判断，通常用变性 PAGE（同序列分析的PAGE。 第二节单链DNA勾象多态性 单链构像多态性（si ngle strand con formation polymorphism, SSCP）?是指单链DNA在溶液中形成立体构象， 等长的DNA片段因其序列中核苷酸的组成和排列顺序不同， 形成的构像不同，在非变性PAGE寸表现为电泳速度的 差别。单链DNA的构像分析对？DNA?序列的改变非常敏感，？常常一个碱基的差别都能显示岀来。 ？据此Hayashi等 人发明了 SSCF分析方法。 SSCP 的结果判定是通过与正常样品对比， 观察条带位置的改变。 分析多个样品时可不设正常对照。 正常样品 除未变性彻底的双链外， 一般岀现两条带， 为正链和负链，电泳条件不好时， 正负链分不开。有时会岀现3条链， 机理不清。岀现额外区带时即可判断有多态性， 多态性带有时为2条有时只有1条。 双链的位置随电泳条件不同 改变很大， 设置双链对照是为了判别额外的带是多态性还是双链。 当变性不彻底时会岀现双链带，有多态性的样 品，带型更多，除同源双链外还有异源杂合双链的带。 SSCP的检测条件因DNAt段及核苷酸取代而有很大差别，没有统一的电泳条件，下面列岀的几个参数供摸索 时参考。加样不要过量，过量加样不仅条带扩展拖尾，使多态性带与正常带重叠不易判断，还往往会变性不彻底 而岀现双链特别是异源双链的干扰。 具体操作如下： 1.常规PCR产生DNA片段（可加入1 uCi 32P dCTP ）。 2?配制PAG（非变性） 5 %或6 %聚丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺一般为 49:1 ） 甘油浓度有3种： 0％、 5％、 10％。 胶长不小于20 cm,胶厚0.4 mm。最好用鲨鱼齿加样梳。 预电泳 电泳温度依分离的片段特征而选定，一般试三种温度：室温（ 20 C） 15? C或4C，一般通过恒温循环水 浴控制。预电泳1小时使胶的温度平衡。 DNA样品处理 取适量的PCR扩增产物加3 ul序列胶加样液（90甲酰胺，？含少量二甲苯蓝和溴酚蓝染料）， 95C加热变 性2 min ，冰浴中骤冷。同位素掺入的取 1ul 稀释10倍，加样 3 ul ，银染的一般用 5 ul 。 电泳 用吸管将加样孔中游离的丙烯酰胺和甘油吹洗干净，将样品加入， ?在单独的样品孔中加未经变性处理的 PCR 产物作为双链 DNA 标志。 电泳时有恒温控制时电压可高些，一般电泳功率 30瓦，？无恒温装置时可用电扇降温，亦可用 200V电泳过 夜。 6?放射自显影或银染显示分析结果。 ？放射自显影的凝胶转贴到普通滤纸上，包保鲜膜压片 -80 C曝光。 第三节 聚丙烯酰胺凝胶银染色 PCR 产物电泳后， 将粘附凝胶的玻板浸在 10%乙醇 0.5？ %乙酸固定液中使胶脱落， 在摇床上固定凝胶 15min， 换0.2 % AgNO3染色10min左右，？用去离子水短暂冲洗3次， 1.5 % NaOH0.4 %甲醛显色至适度，最后用固定液终 止显色。 ？将显色好的凝胶转贴到普通滤纸上，真空抽干，保存。亦可照相保存结果。抽干的胶照相时，可用二 甲苯处理滤纸使之透明 硝酸银溶液可回收反复使用，随着染液的老化（耗竭），染色时间要逐渐延长。显色液混入染色液中会使染 液很快失效。 染色以后的去离子水冲洗对减轻本底非常重要， 一定注意不得用自来水冲洗， 自来水中离子会使凝 胶变黑。 第四节 性别鉴定 在X-连锁的隐性遗传病（如 DMD、血友病）的产前诊断中，确定胎儿性别非常重要，若胎儿为女性一般不再 进行基因型的诊断。 应用ZFY/ZFX的同源序列的引物进行双重 PCR，可准确诊断胎儿的性别。 ZFY位于Y染色体 短臂末端，？ZFX位于X染色体短臂末端， 二者有很大的同源性。弓I物XY位