外显子捕获具体步骤以及各试剂的作用[宣讲].pptxVIP

外显子捕获 余晗 ; 外显子 是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 在人类基因中大约有180,000个外显子，占人类基因组的1%，约30MB。人类基因组的蛋白编码区域大约包含85%的致病突变。 外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略，外显子测序??对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。 对肿瘤基因突变检测具有显著意义，因为外显子测序容易提高深度，可以轻易达到100X、200X。 而因为外显子捕获是有偶然性的，对小片段结构变异、拷贝数变异很难检测。 ;外显子组包含合成蛋白质所需要的重要信息序列。 外显子序列捕获芯片（或溶液）可在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获研究者感兴趣的目标外显子区域，后续测序直接解析数据。? ;发现外显子区的绝大部分的疾病相关变异 可发现常见变异和频率5%低频突变 只对基因组的约1%测序，更加经济、高效人的全基因是3G，如果要把全基因都测一下，一般要平均30x的覆盖。也就是要90G的数据。这样的测序量，成本大约是一个样本6万多元。如果样本多的话，费用上可能负担不起。?而外显子只占人全部基因序列的1%，而且是最关键的1%。把外显子全都测了，就相当于抓住了问题的主要矛盾。同时测序量大大降低。这就是用外显子测序来替代全基因重测序的第一个原因。 在相同预算情况下，可提供更高深度测序第二个原因是在做肿瘤测序的时候，肿瘤本身存在着较大异质性。肿瘤的基因序列是不稳定的，一直在变的，也就是肿瘤的深部、浅部可能其基因序是不一样的。为了测出各种突变，就需要有较深的测序重度，比如100x、甚至200x的测序深度。这时候外显子测序就可以做到高的测序覆盖度，同时费用不会太高。 ;劣势：;;;; ; ; ;Library Prep Kit Pure Capture Bead Kit Adapter Kit (A and/or B) pcr ReadyMix Hybridization and Wash Kit DNA Covaris打断仪 DNA 真空浓缩仪 金属浴 片段大小：180－220bp 测序平台：Illumina Genome Analyzer II、HiSeq 或MiSeq 测序仪 实验周期：2天;1.杂交（47℃，16-20h）;cot1-DNA;;; 外显子捕获效率是什么？ 外显子测序过程中要用到杂交???程。 在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分，这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。所以，测到的序列中，有一部分不是外显子序列。我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比列称为捕获效率。 Nimblegen大约是70% Agilent大约是60% Illumina大约是50% ;2.磁珠捕获及洗脱;3.pcr扩增;Thanks！;;; 1 SureSelect Library Prep Kit. 2 SureSelect Target Enrichment Kit Indexing Hyb Module Box #2 3 Herculase II Fusion DNA Polymerase 4 SureSelect Target Enrichment Kit Box #1 片段大小：150-200bp 测序平台： Illumina HiSeq、 MiSeq 实验周期：2天;;TruSeq?Exome?Library?Prep?Kit ; 片段大小：150bp 实验周期：2.5天;TruSeq?Rapid Exome?Library?Prep?Kit ;优势：试剂盒包含所有流程反应 试剂，周期缩短至1.5天