肝糖原测定实验报告.docx

肝糖原的提取、鉴定与定量 一、 实验目的 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项， 掌握其操作方法。 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况，采用合适的混匀方法) 。 正确掌握溶液转移的操作。 正确操作使用分光光度计。 二、 实验原理 肝糖原的提取、鉴定 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋 白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使 用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将 滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依 靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和 葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。 CuSO4 十 2NaOH — Na SO4+Cu(OH)2 J 2Cu(OH)2 十 C6H12O6 — 2CuOH十氧化型葡萄糖 +H2O 2CuOH — CuOj 红色)+H2O Cu(OH)2 — CuOiM色 )+H2O 肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物 —5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在10-100^g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。 利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色， 通过标准对照法（直接比较法） 即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先 置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。 三、材料与方法：以流程图示意 实验材料： （一） 仪器 普通离心机，室温“00C恒温水浴箱（*）,分光光度计，精度为10mg级电子 天平（X1） 剪刀（X1）,镊子（XI），研钵（X1） 试管架（X），（100X15） mm 试管（X3） 刻度吸量管（2mLX1，5 mLX2），1000 ^L微量可调取液器（X） 100mL 容量瓶（X） 白瓷反应板（X） （二） 实验样品和试剂 鸡肝。 95%乙醇。 0.31mol/L（5%）三氯醋酸溶液。 0.15mol/L NaCl 溶液。 12mol/L HCl。 12.5mol/L(50 % )NaOH。 碘试剂。 班氏试剂。 5.35mol/L(30%)KOH 溶液。 标准葡萄糖液(50mg/L)。 17mol/L(90 % )H2SO4(用于制备蒽酮显色剂)。 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g,用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此试剂不稳 定，以当日配制为宜，冰箱保存可用 4-5d。 实验方法： 吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器，吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。 (一)肝糖原的提取与鉴定 操作流程如下： 鸡肝约1.0g，剪碎 I + 5%CCl3COOH 1 ml 研磨至乳状 | + 5%CCl3COOH 3 ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心 3分钟(4000 r / min) I 沉淀(弃去) 上清(取2 ml) | + 2ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟 离心5分钟(4000 r / min) \ 上清(弃去) 沉淀 | +蒸镏水1 ml 沸水浴2分钟，溶解沉淀糖原溶液1ml白瓷板孔穴中+浓HCI 5滴加碘试剂2滴 沸水浴2分钟，溶解沉淀 糖原溶液1ml 白瓷板孔穴中 +浓HCI 5滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却 加碘试剂2滴 糖原水解液2滴 + 50%NaOH 5 滴 糖原水解液 +班氏试剂4滴 混匀 沸水浴2分钟，观察变化 注意事项 肝糖原提取一步，向上清液中加入 95%乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为 水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。总量相对较多，混匀操作比较困难，最好 用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残 基在20个以下的会使碘呈现红色，20, 30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈 现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在 20个以下（通 常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑 浊，观察不到应有的结果。 （二）肝糖原定量测定 操作流程如下: 鸡肝0.10 g | + 30%KOH 1.5ml （用吸量管） 沸水浴15分钟 I 冷却，全部转入100 ml容量瓶中 I 加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液 糖原的