基因突变筛选检测技术_cropped.docx

综述 基因检测技术? 基因突变筛选检测技术 张晓莉综述府伟灵审校 （第三军医大学西南医院基因诊断与治疗中心 ，重庆400038 ） 摘要：有关基因突变的检测技术，除DNA测序外，检测未知点突变的方法总体上可分为两大类 ：一类基于野生型与突变型 核酸在电泳中泳动速度上的差别；另一类则为切割杂合体的方法。本文将对其可操作性和质量评估作一综述 。 关键词：基因；突变；检测 中国分类号：Q754 文献标识码:A 文章编号：100623730 (2002 ) 0120013203 作者简介： 作者简介：张晓莉（1972）女，第三军医大学硕士毕业，其间曾赴香港中文大学进行有关遗传性疾病基因诊断和基因治疗的合作研究 ，现在校 目前世界上已报道了多种不同的点突变及微小缺失 、微 小插入突变的筛选方法。为了合理的选择这些方法 ，须考虑 以下诸多因素1 : （1）所分析的是哪一种类型的核酸 （DNA或 RNA）。（2）分析的样本种类（如外周血、骨髓、组织、分泌物或 排泄物）。（3）分析前突变是否已知 。（4）突变的数量估计有 多大。（5）是否需要检岀所有可能存在的突变 。（6）野生型与 突变型等位基因量的比例有多大 。（7）方法的可靠性及其标 准化程度。（8）实验如何进行。（9）此方法是否可用于常规诊 断。（10）质量评估如何。 以下将围绕这些要点对不同的突变筛选方法进行综述 。 尽管在此没有提及 DNA测序的方法，但其仍被认为是检测突 变的“金标准”。正因为这个原因，所以由筛选方法筛选岀来 的突变必须经DNA测序来证实。目前除PCR产物直接测序 外，检测未知点突变的方法可分为两大类 ：一类基于野生型与 突变型核酸在电泳中泳动速度上的差别 ；另一类则为切割杂 合体的方法。近年来，一种基于错配结合蛋白与杂合体中错 配碱基结合的新方法也曾有报道。本文在此将着重介绍这些 筛选方法的可操作性和质量评估 。 变性 梯度凝胶电泳（Den at uri ng gradie nt gel elec2 t rop ho resis ,D GGE） / 温度梯度凝胶电泳 （Temperat ure gradient gel elect rop horesis , T GGE） 其原理是双链（ds） DNA在递增的变性剂浓度梯度或递增 的温度梯度中进行电泳 ，随着变性剂浓度或温度的递增 ，DNA 上的不同区段则依据它们不同的熔解温度 （Tm）而解离。长 度在1001000bp之间的DNA杂合体内有25个这样的区段，每 一段都在一特定的温度下解离，进而导致DNA在电泳中的速 度减慢。杂合体中碱基的错配会造成相应区段的不稳定 ，致 使同源体与 杂合体之间相应区段Tm的差异最大可达6 Co 由此分别由一条野生型和突变型单链所形成的 DNA杂合体 常被用来作点突变的分析。为了增加可分析的区段，在PCR 的引物末端加上了含 GC丰富的序列，即GC夹2 o GC夹的 应用使更多的突变可被 D GGE检测到。 D GGE所能检测的最大片段长度约为 1000bp o片段上所 含的Tm越多，其电泳的速度变化会越小 ，因此随着DNA片 段长度的增加，能检岀的突变数会减少。此外，对于长度在 50bp至1000bp之间的片段，电泳分离的时间大约在 715h10 h 之间。 据文献报道，当所检测的DNA同时包括由正义链和反义 链所形成的杂合体，且链的末端附带有 GC夹时，约100 %的 点突变可被检出2 。但就其检出限而言 ，D GGE和T GGE似 乎并不适合于存在有大量野生型等位基因的背景中去检测少 量的突变基因。 D GGE/ T GGE在分析每一特定的 PCR片段之前需要通 过预实验来 确定其最佳的电泳条件，以获得最大的分离度。 从理论上讲，DNA变性及复性之后可检测到四条带，分别对应 于所形成的两个 同源体（WW ，MM 和两个杂合体（WM ， MW。对于来源于生殖系的纯合性基因突变，只有加入了野 生型DNA后才可检测到四条带型 。条带的相对密度取决于 突变型与野生型 DNA量的相对大小，这一点在某些应用中可 能会产生一些问题，尤其是在肿瘤的应用中，因为其中含有不 等量的非肿瘤DNA分子，可能会岀现由于杂合体条带较弱而 难于分辨的情况。 单链构象多态性 （Single strand co nfo rmatio n poly 2 mo rp hism，SSCP） 其原理是在某一条件下，单链（ss）核酸在溶液中会形成一 定的二级结构，其中碱基的组成会影响二级结构的形成 。单 个核苷酸的变化会改变 ssDNA的二级结构，致使其在非变性 电泳中泳动的速度发生变化3 。最初，SSCP只用于分析 DNA，而后在RNA的分析中也有一定的应用。RNA较之 DNA分子更易在溶液中形成特定的二级结构 。