生物制药学实验指导[借鉴].pdfVIP

实验一 细胞色素 C 的制备及测定 一、实验目的 1．学习细胞色素 C 的理化性质及其生物学功能。 2．掌握制备细胞色素 C 的原理。 3．掌握制备细胞色素 C 的操作技术。 二、实验原理 细胞色素 C 是呼吸链的一个重要组成成份。是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体 呼吸链上位于细胞色素 b 和细胞色素 aa 3 之间， 细胞色素 C 的作用是在生物氧化过程中传递 电子。 细胞色素 C 分子中含赖氨酸较高， 所以等电点偏碱， 为 pH 10.8，分子量为 12000～13000 道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从 细胞中浸提出来。细胞色素 C 分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存， 一般都将细胞色素 C 制成还原型的，氧化型细胞色素 C 在 408nm 、530nm 有最大吸收峰， 还原型细胞色素 C 的最大吸收峰为 415nm 、 520nm 和 550nm ，这一特性可用于细胞色素 C 的含量测定。 由于细胞色素 C 在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验 以猪心为材料， 经过酸溶液提取，人造沸石吸附， 硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制 备细胞色素 C ，并测定其含量。 三、实验材料 1. 实验器材 绞肉机；电磁搅拌器；离心机； 72l 型分光光度计；玻璃柱 (2.5 ×30cm) ；三角瓶；试管 （多支，25 mL ）烧杯 (1000 、500mL) ；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋。 2. 实验试剂 ⑴ 2M H 2SO4 溶液； 1M NH 4OH 溶液；固体硫酸铵 ⑵ 25 ％硫酸铵溶液 : 100mL 蒸馏水中含 25 克硫酸铵，约相当于 25 ℃时 40 ％的饱和度 ⑶ 0.2％氯化钠溶液：称 0.2 克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至 100ml. ⑷ BaCl 2 试剂： 称 12 克 BaCl 2 , 溶于 100ml 蒸馏水中。 ⑸ 20 ％三氯醋酸溶液 (6) 人造沸石 2 2 4 2 ⑺ 联二亚硫酸钠 (Na S O 2H· O) 三、实验操作 1．细胞色素 C 的制备 ⑴ 材料处理 : 取新鲜或冰冻猪心， 除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞 碎。 2.提取 : 2 4 称取绞碎猪心肌肉 100 克，放人 500mL 烧杯中，加蒸馏水 200ml ，以 2M H S0 调 pH 至 4.0( 此时溶液呈暗紫色 )，在室温下搅拌提取 1 小时，在提取过程，使抽提液的 pH 值保持 在 4.0 左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以 1M NH4 0H 调 pH 至 6.0 ，停止搅拌。离 心 3000r/min ，10min （或用 8 层纱布过滤） ，收集上清液。残渣加入 150mL 蒸馏水，再按上 述条件提取 1 小时，两次提取液合并。 3. 中和 : 用 1M NH 4OH 调上述提取液至 pH 7.2( 此时，等电点接近 7.2 的一些杂蛋白溶解度小， 从溶液中沉淀下来 )，静置 30～40 分钟，收集上层澄清液；将下层悬浮液，离心 3000r/min ， 10min （或纱布过滤），取上清液与前面的液