酶的分离纯化知识讲解.ppt

酶的分离纯化;细胞结构与酶分布;胞内酶：在细胞中，酶在核糖体上;选用技术前，需考虑：1.目标酶;不同酶的分离、提纯方法，主要根;酶的提取、分离纯化技术路线细胞;酶的分离纯化可以分为三个阶段1;主要过程： 细胞破碎 ? 酶;一、酶分子制备的前处理 1、;材料选定后要尽可能保持新鲜，尽;动物组织要先除去结缔组织、脂肪;2、 细胞的破碎将细胞和组织破;机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物;机械法（注意预冷）：捣碎法：1;物理法：反复冻融法：时间长，需;化学与生物化学方法自溶法：利用;动物 　 　细菌 　　　　　;3.生物大分子的提取（抽提）“;酶提取时首先应根据酶的结构和溶;提高温度，降低溶液粘度、增加扩;⑴ 盐溶液提取：一般以低盐溶液;大多数蛋白类酶都溶于水，而且在;无标题;(2)稀酸（碱）溶液提取在偏离;(3)变性剂的使用如：脲、胍等;典型的抽提液组成离子强度调节剂;（4） 有机溶剂提取一些和脂类;酶的主要提取方法提取方法使用的;二、酶分离纯化的基本技术（简介;无标题;(一)沉淀—— 根据不同物质在;无标题;+++++++带正电荷的蛋白质;酶分子制备中最常用的几种沉淀方;中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分;在盐浓度达到某一界限后，酶的溶;中性盐的选择 常用的中性盐有;② 分离效果好：有的提取液加入;影响盐析的因素盐饱和度的影响?;pH的影响???但硫酸铵具腐蚀;注意事项：添加固体时，要加粉末;2、有机溶剂沉淀 ;有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。;基本原理有机溶剂沉淀主要是降低;优点： ①分辨能力比盐析;3、选择性变性沉淀法 利用蛋;4 、等电点沉淀法等电点沉淀法;氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两;5、 有机聚合物沉淀法有机聚合;优点：①操作条件温和，不易引起;（二） 透析利用透析袋把大分子;（三） 过滤;过滤的分类及其特性(根据过滤介;无标题;四种常用膜分离过程的截留特性;超滤 超过滤即超滤，超滤是;优点：操作简便，成本低廉，不需;缺点：不能直接得到干粉制剂。对;（四）电泳电泳是指在电场的作用;无标题;琼脂糖凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳;1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAG;SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（S;无标题;无标题;制备式???泳通常以不含 SDS ;有几个方法可以鉴定蛋白质的位置;（五）离心 离心技术主要用;无标题;密度梯度区带离心法（简称区带离;差速离心法;（六）层析层析法又称色谱法（C;无标题;层析分离方法 层析方法分离依据;离子交换层析;无标题;无标题;凝胶渗透层析;亲和层析--利用生物分子与配基;酶与底物酶与竞争性抑制剂酶与辅;无标题;（七）浓缩、干燥和结晶浓缩：低;酶高温失活，一般在60℃以下，;冷冻干燥将酶液降温到冰点以下，;结晶结晶与沉淀的区别沉淀和结晶;酶在结晶之前，酶液必须经过纯化;三、分离纯化方法的选择及基本步;前处理：粗分离：细分级：结晶：;四、分离提纯操作要求尽量减少酶;⑴ 早期分离纯化特点：①粗提取;⑵晚期分离纯化 可选用的方;注意的问题： ①盐析后要及时;④分离纯化步骤前后要有科学的安;五、酶的活力测定与纯度测定1.;2.纯度鉴定：方法很多，检验是;鉴定依据：酶分子的大小、形状：;Northrop分析法在一定体;用提纯的酶免疫动物，可获多抗，;六、酶的保存主要任务： 维持酶;（一）影响酶稳定性的因素温度：;温度：一般情况：低温条件（0-;pH值与缓冲液缓冲液：在某个区;氧：部分酶在空气中不稳定，易缓;酶蛋白浓度和纯度稳定性：低浓度;（二）酶的各种稳定剂底物、抑制;-SH基保护剂：半胱氨酸（Cy;其他：无机离子、金属盐、有机溶;此课件下载可自行编辑修改，仅供