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细胞如何做好转染实验及提高实验效率 ① 从健康细胞开始 Ⅰ 转染实验前，细胞解冻后传代 3 –4 次。 这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。 Ⅱ 仅使用活性 90% 的细胞 —— 使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。 Ⅲ 定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。 a. 请在汇合率达到 90% 之前对细胞进行传代。我们建议您使用胰酶替代物 Cellstripper? 试剂 (Corning 25-056-CI) 使细胞脱壁。 Cellstripper? 试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的 Cellstripper? 来跳过 PBS 洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。 b. 传代条件取决于所用的细胞系。 部分经验法则： 对于快速生长的细胞，倍增时间为 16 小时 (如 HEK-293) ，按 1 ： 10 的比例分瓶。 对于生长缓慢的细胞，倍增时间为 36 小时 (如原代细胞 )，按 1 ： 5 的比例分瓶。 Ⅳ 保留冻存的细胞系， 并定期解冻新细胞。 传代次数高 (30 –40) 时，细胞的生长速度和形态会改变。 ② 进行实验之前，请先规划您的实验。 务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。 Ⅰ 开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。 Ⅱ 计算所需脂质体和 DNA 的储备量，并确认有足够的下列材料： TransfectGRO 减血清培养基 (Corning 40-300-CVR) ，Lipofectamine? 2000 或 Lipofectamine? LTX 试剂，以及 DNA (0.5 –1 μg/ μL) 。 ③ 转染时，请使用优质 DNA 。 Ⅰ 使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备 DNA 。 Ⅱ 通过测量 OD 260/280 值来确定 DNA 纯度，测得的 OD 值应介于 1.7 –1.9] 之间。数值过高或 过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。 Ⅲ 在无 DNA/RNA 酶的水或 TE 中稀释 DNA 。 Ⅳ 制备的工作浓度为 0.5 Amicon? 超滤管 )来浓缩  –1 DNA  μg/ μL 。 可用 。  SpeedVac?  浓缩仪或透析过滤装置  (例如， Millipore ④ 转染当天，将细胞铺板。 Ⅱ 转染时，细胞密度保持在汇合率为  70 –90% 。 Ⅲ 转染时，细胞密度影响转染效率。  为了简化转染优化过程或节省时间，我们建议细胞铺成  2 种不同 的密度，以确保较高的转染效率。 Ⅳ 细胞的铺板和转染可同时进行，正向转染的 2.5 倍以上。  或者通过反向转染操作进行。  反向转染操作中，使用的细胞是正常  / Ⅴ 转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中，且不会影响转染效率。