胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化综合分析.pdfVIP

实验 胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化 在动物胰脏中， 胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。 在生理条件下， 胰蛋白酶原随 胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有 Ca2+ 的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽 链 N - 端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解， 失去一个酸性 6 肽， 其分子构象发生 一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶原分子量约为 24 000 ，其等电点为 pH8.9 ；胰蛋白酶的分子量约为 23 400 ，其 等电点为 pH 10.8 。 胰蛋白酶在 pH3.0 时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（ 0 ℃以下）数周而活性无显著丧 失。 pH ＜3 时，胰蛋白酶易变性。 PH ＞５时，胰蛋白酶易自溶。胰蛋白酶催化活性的最适 pH 为 7.6～7.8 。 重金属离子、 有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。 胰脏、 卵清和大豆中 也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。 实验（一）胰蛋白酶活性测定 [原理 ] 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解， 对于由碱性氨基酸 （如精氨酸、赖氨酸） 的羧基与其他 氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。 此外， 胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧 基所形成的酰胺键和酯键， 有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化 学键的催化水解活性的敏感度为： 酯键＞酰胺键＞肽键。 因此， 可以利用含有这些化学键中 任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。 本实验方法一采用 N- 苯甲酰 -L- 精氨酸乙酯 [ （BAEE ），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester] 作为底物，水解反应如下： N- 苯甲酰 -L- 精氨酸乙酯 （BAEE ）在波长 253nm 下的紫外光吸收远远弱于 N-苯甲酰 -L- 精氨酸 [ （BA ）， benzoyl-L-arginine] 的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下， BAEE 随着酯键 的水解，水解产物 BA 逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加， 以△A 253nm 计算 胰蛋白酶的活性。 胰蛋白酶的 BAEE 单位定义为： 以 BAEE 为底物，在一定反应条件下， 每分钟使△ A 253nm 增加 0.001 的酶量为一个 BAEE 单位。 本实验方法二采用以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活性。以酪蛋白为底物，主 要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。 胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯醋酸沉淀的 小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内，酶的水解滤液在波长 275nm 处光吸收的增值与 胰蛋白酶的活力单位成正比。 测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收作对照， 根据活力单位的定 义，确定样品中胰蛋白酶的活性。活力单位的定义：在一定条件下，每分钟酶水解滤液光吸 收的增值与 1 μmol 酪氨酸在 275nm 处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位 （U ）。 [试剂和器材 ] 1、试剂 （1） 1.0mmol/L BAEE 底物溶液 （2 ） 10mmol/L HCl （3 ）0.1mol/L 、pH8.0 硼酸盐缓冲液 （4 ） 10mg/m Ｌ酪蛋白溶液 取酪蛋白 1g，加 13mL 0.1mol/L NaOH 、蒸馏水 40mL ，置 60 ℃水浴加热至溶解， 放至 室温后，加水稀释调 pH 至 8.0