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qPCR 操作及问题分析 来源： 一般来讲，进行 real-time qPCR MasterMix 都是 2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可 以。由于 real-time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做3 个平行孔，以防在后面的数 据分析中，由于 Ct 相差较多或者 SD 太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为 100-400mM ；模板如果是总 RNA 一般是 10ng-500 ，如果 cDNA ，通常情况下是 1ul 或者 1ul 的 10 倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值， 在操作过程中，还需要根据所用 MasterMix ，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反 应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意： 1. MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在 4 度。 更多的配制 Mix 进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！ 所有成分加完后，离心去除气泡。 每个样品至少 3 个平行孔。 参比或者校正染料（ reference dye ， passive dye ）常用的是 ROXTM（现在已经是 ABI 的 注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测 PCR 产物的荧光值就可以。参比染料的作 用是标准化荧光定量反应中的非 PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供 一个稳定的基线。 现在很多公司已经把 ROXTM 配制在 MasterMix 或者 Premixture 里。如果 反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加 ROXTM 染料校正。 通常来讲， real-time qPCR 的反应程序不需要像常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸3 步。由于其产物长度在 80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断 PCR 产 物的特异性扩增。而溶解程序， 仪器都有默认设置，或稍有不同， 但都是一个在产物进行溶 解时候，进行荧光信号的收集。 3. 仪器设置 所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（ plate setup ）和程序设置（ ogram setup ）。我们以 ABI StepOne 为例，详细看一下反应设置：  pr A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为 “ BioTeke，进”行 “定量 ”实验。 B. 实验方法的选择：我们选用的比较 Ct 的 SYBR Green 方法， Fast 程序，以 cDNA  为模 板进行。 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。 样品的设置： 包括哪个是实验组， 哪个是对照组。 以及负对照的设置和生物重复的设置。 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备 F. 反应程序的设置： 5℃ 2 分钟就可以激活  PCR 反应程序的设置要根据不同公司的 MasterMix DNA 聚合酶（ ABI 的需要 10 分钟）。循环反应是  。比如 BioTeke 的 9 95℃ 15 秒， 60 ℃ 15 秒的 40 个循环。 溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。 或者是仪器说明书上建议的程 序。 反应体系的设置： A-G 这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。 需要注意一点 ABI 仪器需要加 ROX 参比染料，默认的是 ROX。有些公司是把 ROX 或者其 他染料配制在 MasteMix 里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的 MasterMix 进行这一 个步骤的选择。 BioTeke 的 MasterMix 里没有参比染料，所以选择 “none”。 设置好之后，就可以把配置好的 PCR 管放进仪器，点击 RUN！ 五、 Real-time qPCR 数据分析 Real-time qPCR 常见参数基线（ baseline ） 通常是 3-15 个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值（ threshold ） 自动设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。 Ct 值 : 与起始浓度的对数成线性关系。 分析定量时候一般取 Ct:15-35 。太大或者太小都会导致定量的不准确。 Rn（ Normalized reporter ）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。 △Rn：