2020双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法.pptVIP

双脱氧末端终止法 测序的原理 主讲：氧气 yun Frederick Sanger 双脱氧末端终止法 ? DNA 聚合酶不能从 头合成子链 ? 如果 dNTP 的 3 碳上 没有羟基 ? ddNTP —— 双脱氧 核苷酸 基本原理： ? DNA 复制 ? ddNTP 的结构 ? 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 DNA 复制的特点 酶： DNA 聚合酶 模板：单链 DNA 底物： dNTP 引物：需要 引物的作用：提供 3 羟基 末端 ddNTP 的特点 ? DNA 聚合酶不 能够区分 dNTP 和 ddNTP 。 ? ddNTP 3 位不是 - OH ，但 5 磷酸基 团正常。 ? ddNTP 参入到寡 核苷酸链的 3 末端 后， DNA 链的延 长会被迫停止 。 聚丙烯酰胺凝胶电泳特点 精度相当高！ 能分离长度达 300-500 个碱基， 而差别仅一个 碱基的同系单 链核苷酸序列。 操作步骤 1 ．制备单链模板与引物退火 2 ．链延伸 --- 终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果 制备单链模板与引物退火 双链 DNA 单链 DNA 单链 DNA 加 入 引 物 ， 加 热 ， 退 火 带引物的模板单链 DNA 链延伸 --- 终止反应 带引物的模板单链 DNA 核素标记 的 dNTP 分成四管 双 脱 氧 鸟 苷 双 脱 氧 腺