死活细胞的鉴定方法.pptxVIP

活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中要随时记录 细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验 各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死 活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细 胞的存活力是比较常用的办法。 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法 是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别 细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以， 在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。 不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种 办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 常用的方法包括染色法和仪器分析法。 1 染色法 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死 细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细 胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损， 通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝， 又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后 只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的 质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。 美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的 作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原 型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它 们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细???原生 质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA 本;身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。当 FDA 进入活细胞后， 被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质——荧光素，该物质不 能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿色荧光； 而无活力的细胞因不能使 FDA 分解，而无法产生荧光。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。 中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着 色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被 染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性 红混合染色法。 2 仪器分析法 可采用微电极技术（利用死活细胞膜两侧电位的差异）、全自动分析细 胞记数仪和流式细胞仪等，可对细胞的死活进行精确的批量检测。 德国 INNOVATIS 出产的全自动 Cedex 细胞存活率/细胞计数仪/细胞分析 仪是 世界上第一台高分辨率、高清晰度扫描(专利)细胞分析仪，具有全自动台 盼蓝染色、显微 CCD 成象、CEDEX 工作站软件，可用于制药、医学、发酵、免疫、 病理、毒性测试、生物技术等学科的研究开发和工业生产过程中的细胞计数和分 析。自动分析结果，检测分析数据输出（11 项)：总细胞数目，总细胞浓度 (cells/mL) ；活细胞数目，活细胞浓度 (cells/mL)；死细胞数目，死细胞浓度 (cells/mL) ；细胞存活率 (%) ；细胞的平均圆度 (compactness) ；细胞的平 均直径 (um) ；细胞团比例 （Aggregate Rate）；细胞直径分布图 （Diameter Histogram）；细胞团分布图 （Aggregate Histogram）；细胞圆度分布图 (Compactness Histogram) ；细胞生长时间曲线（Cultivation Time Chart）。 流式细胞仪法 用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类：一类是能透 过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质，例如 FDA 可被活细胞持留而发出黄 绿色荧光，若细胞有损伤 则会从细胞中流失，观察不到荧光。另一类是不能透 过活细胞膜，但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色，例如碘化丙啶 （ PI,Propidium iodide ）和溴化乙锭（ EB,Ethidium bromide ）就是常用的 第二类荧光探针。碘化丙啶(PI)不能