2020氨基酸含量的测定茚三酮比色法.ppt

实验九 氨基酸含量的测定 （茚三酮比色法） 1. 实验原理 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、 氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三 酮共热时，产生 紫色化合物 ，最大吸收波长在 570nm 处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基 酸含量成正比，可用比色法进行测定。 氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤： 2. 实验材料、仪器与试剂 材料： 酱油 仪器： 可见分光光度计，分析天平，容量 瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂： 茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。 3. 实验步骤 （ 1 ）样品的处理： 准确吸取 0.5mL 酱油于 100mL 烧杯中，加入 5g 活性炭和 50mL 蒸馏水，置于 80 ℃ 水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣 清洗数遍，收集滤液于 100mL 容量瓶中，定容至 刻线，摇匀备用。 各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴 15min ，取出冷却至室 温后加水至 10mL 刻度线，静置 15min 后，在 570nm 处测定吸光度， 以氨基酸含量 (μg) 为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （ 2 ）标准曲线的绘制 管号 1 2 3 4 5 6 7 氨基酸标准溶液 /mL 0 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 水 /mL 1.6 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 磷酸盐缓冲液 /mL 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 茚三酮 /mL 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 氨基酸含量 / μg 0 100 120 140 160 180 200 按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行 实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标 准曲线上查出氨基酸含量微克数。 （ 3 ）样品测定 管号 8 9 10 11 样品溶液 /mL 0 0.5 0.5 0.5 水 /mL 1.6 1.1 1.1 1.1 磷酸盐缓冲液 /mL 0.4 0.4 0.4 0.4 茚三酮 /mL 0.4 0.4 0.4 0.4 4. 结果计算 5. 说明及注意事项 （ 1 ）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可 达 0.5μg ，其其灵敏度高，重现性好。 （ 2 ）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色， 最大吸收波长在 440nm 处。 （ 3 ）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎 后的样品 5g ～ 10g 或吸取液体样品 5mL ～ 10mL ， 置于烧杯中，加入 50mL 蒸馏水和 5g 左右的活性炭， 加热煮沸，过滤。用 30mL ～ 40mL 热水洗涤活性 炭，收集滤液于 100mL 容量瓶中，加水至刻度线， 摇匀备用。