2020氨基酸纸层析.ppt

2019/3/28 1 实 验 一 氨基酸纸层析 2019/3/28 2 1 、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层 析的原理和操作技术； 2 、掌握分配层析法； 3 、掌握影响分配系数的因素。 一、实验目的： 2019/3/28 3 层析技术 ( chromatography 色谱技术 ) 一、发展史 ： 层析分离技术在 20 世纪初就已得到应用： ? 1903 年用于植物色素的分离 , 各种色素以不同的速率流动后形成不 同的色带而被分开，由此得名为“色谱法” ? 1931 年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体； ? 1944 年出现了以滤纸作为支持物的纸层析； ? 20 世纪六十年代末出现了高效液相色谱 (HPLC) 。 2019/3/28 4 二、定义 层析技术 是根据被分离的混合物中各组分的 理 化性质 （分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两 相（一相为固定的，称为 固定相 ；另一相流过固定 相，称为 流动相 ）中进行分配。 层析的基本概念 2019/3/28 5 ? 固定相 ：固定相是层析的一个基质。它可以是固 体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可 以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。 ? 流动相 ：在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质移动的液体、气体等，都称为流动相。 柱层析 中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 层析的基本概念 2019/3/28 6 三、层析技术的种类 ? 1 、按流动相的状态分类： （ 1 ）液相层析（色谱） （ 2 ）气相层析（色谱）； ? 2 、按固定相的使用形式分类： （ 1 ）柱层析（ 2 ）纸层析（ 3 ）薄层层析； ? 3 、 按分离过程所主要依据的物理化学性质分类： （ 1 ）吸附层析 （ 2 ） 分配层析 （ 3 ）离子交换层析 （ 4 ）凝胶层析 （ 5 ）亲和层析等。 2019/3/28 7 纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的 分配层析 。 滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为 固定相 ， 通常把有机溶剂作为 流动相 。 将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在 两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同， 不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些 氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点 二、实验原理 : 2019/3/28 8 分配层析法： 利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的 分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的 分配系 数α是一个常数。 溶质在 固定相 的浓度 (Cs) 分配系数 α= 溶质在 流动相 的浓度（ Cl) 2019/3/28 9 溶剂系统： 正丁醇：甲酸：水 =15 ： 3 ： 2 固定相 ： 水和滤纸纤维素有较强的亲和力， 因而其扩散作用降低形成 固定相 ; 流动相 ：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在 滤纸毛细管中自由流动，形成 流动相。 由于混合液中各种氨基酸的α值不同，所以 移动速率（即 迁移率 R f 值 ）就不同，从而达 到分离的目的。 2019/3/28 10 移动速率 ( 比移值 ) ： 原点到层析点中心的距离 R f = 原点到溶剂前沿的距离 2019/3/28 11 影响 R f 值的主要因素： R f 决定于被分离物质在两相间的分配系数以及 两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体 积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物 质分配系数不同， R f 也就不同。 （ 1 ）物质的结构和分子极性： 物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也 就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间 的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中， R f 小；反之 ,R f 则较大。 2019/3/28 12 （ 2 ）