植物组织培养 第3章 植物组织培养技术灭菌方法无菌操作技术1.ppt

第三章 植物组织培养技术 --- 灭 菌方法、无菌操作技术 内容： 灭菌 无菌操作 愈伤组织的分化与再分化、脱分化 形态发生 教学目的要求 1 ．掌握外植体的选择条件与消毒方法； 2 ．掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件； 3 ．了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形 成过程、形态发生的调控方法，掌握愈伤组 织的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组 织培养的基础技术。 4 ．一般掌握离体叶片和离体根培养基本过 程（选修）；掌握离体茎培养的种类和操作 步骤； 本节教学重点、难点： 重点： 无菌操作技术；组培苗的培养 难点： 无菌操作技术 第一节 外植体的选择和消毒 一、外植体的选择 选取性状优良的种质或特殊的基因型 1. 选择健壮的植株 ： 健壮、无病虫 、发育正常 代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功 2. 选择最适的时期 ： 旺盛生长期 注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶 生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多， 不易消毒而难以培养成功。 3. 选取适宜的大小 ： 一般 0.5-1cm; 脱毒 0.2-0.3mm 材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受 伤害胁迫、多 形成愈伤组织， 甚至难于成活 外植体（叶）的各个部分其芽、苗再生能力也很不相同 胶皮枫香树（ Liquidamnbar styraciflua “Variegata” ）叶 片外植体的供体及叶的部位对其不定芽形成的影响 外植体 部位 每个外植体形成不定芽分生组织的数目 由培养基上增 殖苗中的叶片 由温室生长 2 年的完 整植株上的叶片 叶 柄 叶 片 总 数 6.7 8.0 14.7 6.7 50.3 57.0 外植体培养于 WPM 附加 0.1mg/L NAA 和 2.5mg/L BA 的培养基中，实验用外 植体数为 70 二、灭菌与消毒 （一）有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是： 凡是暴露在空气中的物体， 它的表面都是有菌的。 无菌的范畴： 经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其 他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。 菌类： 细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。 茵的特点 ： ☆极小 ，肉眼看不见； ☆ 无处不有， 适应能力强； ☆繁殖力极强 ，条件适宜时便可大量滋生。 消毒： 指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不 再发生危害作用的过程。 （二）常用的灭菌与消毒方法 灭菌方法 ： 物理方法： 如干热 ( 烘烧和灼烧 ) 、湿热 ( 常 压或高压蒸煮 ) 、射线处理 ( 紫外线、超声波、 微波 ) 、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等灭 菌措施； 化学方法： 使用升汞、甲醛、过氧化氢、 高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理，以达灭菌效 果。 1 . 湿热灭菌（培养基） 高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外 溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度 也随之增加。在 o ． 1MPa 的压力下，锅内温度达 121 ℃。在 此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽 孢。 常用方法： 关闭放气阀，通电后，待压力上升到 O ． 05MPa 时，关电源，打开放气阀，放出空气，待压力 表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上 升达到 0 ． 1MPa 开始计时，压力 0 ． 1---0 ． 15MPa ， 20min 。 注意： 1 、培养基在制备后的 24h 内完成灭菌工序。 2 、完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸 气，灭菌才能彻底 。 2. 灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ） 镊子、剪子、解剖刀等： → 浸入 95% 的酒精中 → 酒精灯火焰上灼烧灭菌 → 冷却后，立即使用。 3. 干热灭菌（ 玻璃器皿及耐热用具） —— 利用烘箱加热到 160-180 ° C 的温度（ 持续 90min ） 来杀死微生物。 注意： 1 、 干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为 包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的