AKR1B10对肝癌细胞增殖和细胞周期调控的作用及机制研究.pdfVIP

摘 要 目的：醛酮还原酶1B10 （aldo-keto reductase 1B10, AKR1B10 ）在肝癌组织中表 达升高，有研究表明其与肝癌早期诊断和预后密切相关，本文将探讨AKR1B10 在 HepG2 肝癌细胞中对细胞增殖和细胞周期的影响及作用机制。 研究方法：1）L02 、HepG2 、Huh-7 人肝（癌）细胞培养；2 ）采用慢病毒 LV-AKR1B10-shRNA 感染HepG2 肝癌细胞，荧光显微镜、蛋白质印迹法（Western blot ）及实时荧光定量PCR 法（RT-qPCR ）检测AKR1B10 的转染效率，空载体组 命名为HepG2/NC ，目的组命名为HepG2/AKR1B10 ；3 ）通过测定还原型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸磷酸在340 nm 处吸光度值的下降检测AKR1B10 的活性；4 ）CCK-8 法检测0、50、75、100、125、150μmol/L 依帕司他分别培养HepG2 细胞24 、48 、 72h 后HepG2 细胞的增殖活性；CCK-8 法检测HepG2、HepG2/NC 、HepG2/AKR1B10 肝癌细胞24 、48 、72h 的增殖活性；5 ）流式细胞术检测0、50、100μmol/L 依帕司 他培养HepG2 细胞24h 后细胞各期的比例；流式细胞术检测HepG2、HepG2/NC 、 HepG2/AKR1B10 细胞周期的比例；6 ）Western blot 检测0、25 、50、100μmol/L 依 帕司他培养HepG2 细胞24h 后p-Rb 、cyclinD1 、cyclinE1 、p27 的蛋白表达水平， Western blot 检测HepG2、HepG2/NC 、HepG2/AKR1B10 细胞中p-Rb 、cyclinD1 、 cyclinE1 、p27 的蛋白表达水平。7 ）所有数据以均数±标准差( x ±s)进行统计描述， 两组间比较采用独立样本t 检验，所有实验均重复三次，采用 SPSS 24.0 软件进行 数据的统计学分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。 结果：1）AKR1B10 在肝癌细胞中表达升高。和正常肝细胞L02 相比，HepG2 肝癌细胞中 AKR1B10 蛋白相对表达水平为 6.71±1.11 （P=0.012 ）。Huh-7 细胞中 AKR1B10 蛋白相对表达水平为 3.32±0.39 （P=0.009 ）。2 ）构建 AKR1B10 低表达 HepG2 细胞系，相比于空载组，稳定转染株AKR1B10 RNA 表达水平为0.19 ±0.03 （P=0.001 ）。AKR1B10 蛋白水平为0.24 ±0.07（P=0.002 ），转染效率约为70%~80% 。 3 ）50，75 ，100，125，150μmol / L 依帕司他分别作用于HepG2 细胞24 ，48 ，72h 后，随着依帕司他的作用浓度和作用时间的增加，对HepG2 细胞的抑制率逐渐增加； HepG2/NC 细胞培养24 ，48 ，72h 的吸光度值分别为0.67 ±0.06 ，1.34±0.05 ，1.82 ±1.11；而HepG2/AKR1B10 细胞培养24 ，48 ，72h 的吸光度值为0.54 ±0.06 ，1.02 ±0.09 ，1.36±0.08 ，较空载体组显著降低 （P ＜0.05 ）；4) 依帕司他可以显著抑制 I AKR1B10 酶活性，呈剂量依赖性特点，然而与对照组相比，不同浓度依帕司他处 理的HepG2 细胞中AKR1B10 的表达水平并无明显变化；5) 相比对照组，100μM 依帕司他可显著增加HepG2 细胞G1 期的比例（65.44 ±1.78 比61.29 ±1.81，P=0.047 ）。 与HepG2/NC 细胞相比，HepG2/AKR1B10 细胞中 G1 期的比例显著增高 （58.24 ± 1.14 比49.33 ±2.94 ，P=0.008 ）。6 ）Western blot 结果表明，50、100μmol / L 依帕司 他可显著抑制细胞周期蛋白 cyclinD1 ，cyclinE1 和 p-Rb 的表达，同时促进周期素 依赖性激酶抑